[发明专利]一种组织工程心肌补片制备方法

说明书

本发明公开了一种组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取成年猪心；S2、冲孔机打孔获取左心室心肌块；S3、心肌块冻存于‑80℃至少16小时；S4、解冻心肌块，切取厚度为1cm心肌块并用琼脂糖包埋；S5、用陶瓷叶片振荡切片机，切割心肌块，获得厚度约为300‑500μm、直径约为14mm的心肌组织薄片；S6、制备得到去细胞心肌组织薄片；S7、将hiPSC‑CM体外定向诱导分化14‑16日；S8、胰蛋白酶消化获取细胞悬液，以2×107个细胞/cm2接种量，种植iPSC‑CMs于S6制备的去细胞心肌组织薄片，继续培养载hiPSC‑CM组织工程心肌薄片1‑28日得到组织工程心肌补片。该组织工程心肌补片制备方法，制备方法过程简单，可以稳定高效的满足对组织工程心肌补片的培养制备，满足医疗使用要求。

技术领域

本发明涉及人胚胎干细胞和诱导型多能干细胞分化为增殖心肌细胞的方法设计技术领域，尤其涉及一种组织工程心肌补片制备方法。

背景技术

根据《中国心血管病报告2015》，2014年心血管病死亡率仍居首位，每5例死亡中就有2例死于心血管病。与1990年相比，2013年心血管病死亡的绝对数字增加了46％；其中，缺血性心脏病死亡人数增加了90.9％。冠状动脉堵塞造成的缺血和随后的再灌注会引起不可逆的细胞损伤，造成心肌细胞坏死，心脏收缩功能下降。由于成体心肌细胞缺乏再生能力，无法修复坏死心肌，细胞移植可能成为缺血性心脏病的有效治疗途径。目前，尽管间充质干细胞对心肌梗死病人心功能改善有积极作用，但其在体内分化为心肌细胞的能力有限，长期效果不佳，因此需要更为有效的种子干细胞。胚胎发育过程为干细胞定向分化提供了重要线索，在过去的几年中，通过操控心脏发育关键通路，在心肌定向分化方面取得了重要进展。

但是，在现有技术中，对心肌补片的制备方法复杂，不能简单高效的满足医疗制备心肌补片的要求需要。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种简单、稳定高效，能有效促进多能干细胞分化，并制备得到组织工程心肌补片的组织工程心肌补片制备方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种组织工程心肌补片制备方法，包括如下步骤：

S1、取成年猪心，分离左心室；

S2、冲孔机打孔获取左心室心肌块；

S3、心肌块冻存于-80℃至少16小时；

S4、解冻心肌块，切取厚度为1cm心肌块并用琼脂糖包埋；

S5、用陶瓷叶片振荡切片机，在1mm振幅、速度0.01～0.03mm/秒、100Hz振动频率条件下，切割心肌块，获得厚度约为300-500μm、直径约为14mm的心肌组织薄片；

S6、使用SDS和Trixon X-100液体，洗涤和浸泡心肌组织薄片，制备得到去细胞心肌组织薄片；

S7、将hiPSC-CM体外定向诱导分化14-16日；

S8、胰蛋白酶消化获取细胞悬液，以2×107个细胞/cm2接种量，种植iPSC-CMs于S6制备的去细胞心肌组织薄片，继续培养载hiPSC-CM组织工程心肌薄片1-28日得到组织工程心肌补片。

在一种优选的实施方式中，对S5得到的心肌组织薄片浸于PBS中，保温4℃过夜。

在一种优选的实施方式中，所述步骤S6中，制备去细胞心肌组织薄片的步骤为：

S61、对浸于PBS中，保温4℃过夜的心肌组织薄片用1％SDS洗涤两次，每次1.5小时；

S62、无菌蒸馏水洗涤15分钟；

S63、1％Trixon X-100洗涤7分钟；