[发明专利]一种从桦褐孔菌中提取分离栓菌酸的方法

说明书

本发明提供一种从桦褐孔菌中提取分离纯化栓菌酸的方法。本发明基于50％异丙醇柱层析提取，乙酸乙酯萃取和C18修饰硅胶柱层析等分离制备栓菌酸，具有用时短，低毒性，高提取率以及高纯度等诸多优势，采用本发明提取分离方法得到的栓菌酸呈白色蓬松片晶状，纯度可达90％以上。

技术领域

本发明涉及生物提取技术领域，具体涉及一种从桦褐孔菌中提取分离纯化栓菌酸的方法。

背景技术

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属于真菌门、担子菌亚门、多孔菌科，主要分布在北半球气温较低的地区。在我国也主要分布在黑龙江、吉林(主要分布于长白山)等地。很早以前，人们就发现桦褐孔菌有着特殊的活性。人们用桦褐孔菌泡茶、煎煮慢慢地发现该真菌能够防治胃癌、肝癌、肠癌等多种癌症。栓菌酸(inotodiol)是桦褐孔菌特有的甾醇，体外实验发现栓菌酸不仅能抑制癌细胞的生长还能有效杀伤癌细胞。动物实验表明栓菌酸在体内有显著的促进抗肿瘤机制的发生的作用。有研究发现从桦褐孔菌中分离得到的栓菌酸可以通过抑制真核细胞拓扑异构酶I从而组织细胞DNA复制诱导细胞的凋亡蛋白酶激活来发挥抗恶性细胞增值的作用。体外实验研究发现栓菌酸抑制真核生物拓扑异构酶I的IC50为5μM，表明栓菌酸为一种潜在的临床抗肿瘤药物。

目前，桦褐孔菌中甾醇化合物的提取方法主要为索氏提取法、有机溶剂浸提法、超声或微波辅助提取法等。栓菌酸的分离方法主要有硅胶柱层析反复分离法，高速逆流色谱分离法，高效液相色谱法。普通硅胶柱层析法，产品纯度高，但存在洗脱溶剂毒性强，过程繁琐，用时较长以及产量低等特点。高速逆流色谱法作为一种高效、方便方法被用于科研实验室分离药用植物、药用真菌的有效成分，但该法消耗有机溶剂多，难以放大规模进行工业化分离，使用有局限性。

有鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明的首要目的是寻求一种高提取率、高纯度的提取分离纯化栓菌酸的方法，进而达到用时短，低毒性，高提取率和高纯度等效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、将桦褐孔菌子实体粉碎，加入异丙醇水溶液中，浸泡后加入层析柱中，采用异丙醇水溶液洗脱，得到粗提取液；

S2、将提取液减压回收异丙醇，乙酸乙酯萃取合并，减压回收乙酸乙酯得干粉；

S3、干粉装入有C18修饰硅胶填充的层析柱，采用梯度醇溶液洗脱，收集100％醇溶液洗脱时的主要洗脱峰。

S4、100％醇溶液洗脱峰减压回收醇溶液后，浓缩液冷冻干燥得栓菌酸冻干粉。

在一些实施方式中，所述S1中异丙醇水溶液浓度为50-70％，优选的为50％。

在一些实施方式中，所述S1为：将桦褐孔菌子实体粉碎，按1kg:1～5L的料液比加入到50-70％的异丙醇水溶液中浸泡，浸泡0.4-0.6h后加入层析柱中，采用50-70％的异丙醇水溶液洗脱1个柱体积BV，得到粗提取液。

在一些实施方式中，S1种将桦褐孔菌子实体粉碎，按1kg:1L的料液比加入到50％的异丙醇水溶液中浸泡，浸泡0.5h后加入层析柱中，采用50％的异丙醇水溶液洗脱1个柱体积，所述洗脱流速为1BV/h(即1个柱体积/小时),总洗脱时间为1h，得到粗提取液。

在一些实施方式中，S1中所述层析柱的柱直径：柱床高度＝1:5。

在一些实施方式中，所述S2为：将提取液50-55℃减压回收异丙醇(优选的50℃减压回收)，浓缩为提取液体积的1/2后加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，每次30min，合并上层乙酸乙酯相，55-60℃(优选60℃)减压回收乙酸乙酯得干粉。

在一些实施方式中，S3中干粉按5％柱填料质量装入层析柱中。