[发明专利]一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法

说明书

本发明公开了一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，包括以下步骤：用组织分离法从三七圆斑病病叶上分离槭菌刺孢，获得纯培养菌株；将纯化后的菌株接种到PDA培养基；在20℃全光照条件下的光照培养箱中培养5～7天；用灭菌的手术刀将培养好的槭菌刺孢菌落表面菌丝刮去后切割成圆形菌块；在无菌培养皿中加入无菌的ddH₂O，再将菌块正面向上放入ddH₂O中；将装有菌块的培养皿放入光照培养箱中光暗交替培养；15天后即可获得大量的分生孢子；本发明提出了一种新的分生孢子诱导方法，该方法操作简单，产孢稳定，且整个过程都是在无菌环境下操作的，可以获得纯净的分生孢子悬浮液。

技术领域

本发明涉及植物保护技术领域，具体是指一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法。

背景技术

三七圆斑病病原菌为槭菌刺孢(Mycocentrosporaacerina(Hartig)Deighton)，该菌属于半知菌门菌刺孢属真菌，该病于1993年云南省文山州首次被发现，是危害三七地上部分非常严重的一种病害。槭菌刺孢喜低温高湿，且传播迅速，在三七生长地区，每年雨季来临，如果防治不及时，发病率可达80％以上，对七农造成严重的经济损失。

槭菌刺孢以厚垣孢子在土壤或植物病残体中越冬，是翌年三七圆斑病的主要初侵染源，常在每年雨季发病和流行，发病初期叶片病斑较小，呈圆形或近圆形水渍状，病斑中心可见棕褐色侵染小点，随后病斑逐渐扩大，褐色或灰褐色，发病后期可在病斑表面观察到轮纹状白色或粉白色的分生孢子堆。这些分生孢子可借助风力或雨水飞溅传播，造成三七圆斑病的大面积发生。

槭菌刺孢由于很难在人工培养基上产生分生孢子，目前还没有一种可靠的技术手段可以使槭菌刺孢在人工培养基上稳定的产生分生孢子，专利CN105695389公开了一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法，主要是通过圆斑病菌接种三七活体叶片，一定时间后三七叶片上可以产生孢子，该方法操作复杂，且在培养过程中，三七叶片容易受到其他微生物的污染，所获得的分生孢子悬浮液不纯净。专利CN106085945公开了一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法，该方法通过制作三七地块的土壤液来诱导槭菌刺孢菌丝产生分生孢子，该方法需要采集三七地块的土壤制备土壤液，不仅操作复杂，而且因土壤液中可能存在其他病原菌导致目的孢子悬浮液不纯净。

因此，对于三七圆斑病菌的研究，迫切需要一种操作简单、成本低、高效的纯培养产孢方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是传统方法操作复杂，在培养过程中，容易受到其他微生物的污染，所获得的分生孢子悬浮液不纯净。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，包括以下步骤：

步骤1、用组织分离法从三七圆斑病病叶上分离槭菌刺孢，获得纯培养菌株；

步骤2、将纯化后的菌株接种到PDA(Potato Dextrose Agar)培养基；

步骤3、在20℃、全光照条件下的光照培养箱中培养5～7天；

步骤4、首先用灭菌的手术刀将培养皿菌落表面的菌丝刮去，然后将刮去菌丝的菌落切割成直径3～4cm的圆形菌块；

步骤5、在直径为90mm的无菌培养皿中加入约15～20mL经0.22μm滤膜过滤后的ddH₂O(双蒸水)，再将圆形菌块正面朝上放入ddH₂O中，使ddH₂O刚好淹没菌块；

步骤6、将装有菌块的培养皿放入光照培养箱中，温度设置为20℃，光照和黑暗交替(12h、12h)培养；

步骤7、产孢观察，15天后即可观察到有大量的分生孢子产生，产孢量可达1×10³个/mL。