[发明专利]一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法

权利要求书

1.一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1、用组织分离法从三七圆斑病病叶上分离槭菌刺孢，获得纯培养菌株；

步骤2、将纯化后的菌株接种到PDA(Potato Dextrose Agar)培养基；

步骤3、在20℃、全光照条件下的光照培养箱中培养5～7天；

步骤4、首先用灭菌的手术刀将培养皿菌落表面的菌丝刮去，然后将刮去菌丝的菌落切割成直径3～4cm的圆形菌块；

步骤5、在直径为90mm的无菌培养皿中加入15～20mL灭菌的ddH₂O，再将菌块正面向上放入ddH₂O中；

步骤6、将装有菌块的培养皿放入光照培养箱(20℃、黑暗光照交替)培养；

步骤7、产孢观察，15天后即可获得大量的分生孢子，产孢量可达1×10³个/mL。

2.根据权利要求1所述的一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤1中的用组织分离法从三七圆斑病病叶上分离槭菌刺孢菌株，分离完成后需要2～3次纯化，获得纯培养菌株。

3.根据权利要求1所述的一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤2中采用的PDA培养基配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，蒸馏水1000毫升，自然pH值，100mg/L氯霉素，配制完成后121℃高压灭菌30min。

4.根据权利要求1所述的一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤3中全光照条件是指一天之内24h全时间段光照，无黑暗培养，待槭菌刺孢菌落面积占整个培养皿面积的2/3即可。

5.根据权利要求1所述的一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤4中所使用的手术刀需在高压灭菌锅中，121℃下灭菌30min后使用，菌块切割需要在超净工作台中操作。

6.根据权利要求1所述的一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤5中ddH₂O需经0.22μm滤膜过滤后使用，将菌丝块放入到含有无菌ddH₂O的无菌培养皿中，使ddH₂O刚好淹没菌块。

7.根据权利要求1所述的一种人工诱导槭菌刺孢产生分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤6中需要将培养皿放在恒温20℃和黑暗光照交替条件下15～20天才可以产生孢子，成熟的孢子会漂浮在无菌ddH₂O表面，将无菌ddH₂O倒入50mL离心管中并加入2％的吐温20之后放入低温离心机，在4℃、10000r/min条件下离心5min，然后再根据需要进行稀释即可得到期望浓度的槭菌刺孢孢子悬浮液。