[发明专利]一种肺炎链球菌致死性定量评估方法

说明书

本发明公开了一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，包括如下步骤：用1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50的肺炎链球菌细菌原液，采用液相肺炎链球菌荚膜染色法进行染色，制备得到不同浓度的染色菌液；使用蒸馏水调零，对步骤S1中多组不同浓度的染色菌液分别进行比色，测定619nm波长处的吸光度，绘制标准曲线；将待测样本进行液相肺炎链球菌荚膜染色处理，获得的染色菌液在619nm波长条件下比色，将比色得到的吸光度值在标准曲线上找出对应的LD50数量，得到该样本的致死性量度。本发明提供的肺炎链球菌致死性定量评估方法，不需要采用动物实验，可在数小时内完成测定，是一种简单、易操作、成本低的测定方法。

技术领域

本发明涉及肺炎链球菌致死性测定方法技术领域，具体涉及一种肺炎链球菌致死性定量评估方法。

背景技术

肺炎链球菌是一种人类致病性革兰氏阳性细菌，常引起人类呼吸道感染，如肺炎、咽炎、扁桃体炎等。该菌是一种具有荚膜的细菌，且荚膜是该菌最重要的致死性物质。有荚膜的肺炎链球菌称为有毒株，无荚膜的肺炎链球菌称为无毒株。因此，荚膜与其致病性密切正相关。

半数致死量(median lethal dose，LD50)是常用于评估细菌致死性强弱的量纲。1个LD50是指：在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数死亡所需最小细菌数量。

既往，评估肺炎链球菌的致死性强弱，通常采用LD50测定法。但是这种测定方法需要使用至少数十只动物(通常是小白鼠)做实验，费用高昂，且需要数天时间才能获得测定结果。

鉴于此，克服上述现有技术所存在的缺陷，提供一种简单、易操作、成本低、测定周期短的测定方法，是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，不需要采用动物实验，可在数小时内完成测定，是一种简单、易操作、成本低的测定方法。

为了解决上述问题，本发明提供了一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，所述技术方案如下：

一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，包括如下步骤：

步骤S1，用1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50的肺炎链球菌细菌原液，采用液相肺炎链球菌荚膜染色法进行染色，制备得到不同浓度的染色菌液；

步骤S2，使用蒸馏水调零，对步骤S1中多组不同浓度的染色菌液分别进行比色，测定619nm波长处的吸光度，绘制标准曲线；

步骤S3，将待测样本进行液相肺炎链球菌荚膜染色处理，获得的染色菌液在619nm波长条件下比色，将比色得到的吸光度值在标准曲线上找出对应的LD50数量，得到该样本的致死性量度。

进一步地，步骤S1和步骤S3中，液相肺炎链球菌荚膜染色法包括如下步骤：

将肺炎链球菌菌液在5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；

向菌体沉淀物中加入7％孔雀绿水溶液10ml，轻柔搅匀，在37℃染色20分钟；5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；

向菌体中加入生理盐水10ml,5000转/分条件下离心2分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；

向菌体沉淀物中加入2ml生理盐水，轻柔搅匀，获得染色菌液。

进一步地，1LD50浓度的肺炎球菌＝6.42×10⁸CFU/mL,2LD50浓度的肺炎球菌＝1.28×10⁹CFU/mL,3LD50浓度的肺炎球菌＝1.93×10⁹CFU/mL,4LD50浓度的肺炎球菌＝2.57×10⁹CFU/mL,5LD50浓度的肺炎球菌＝3.21×10⁹CFU/mL。