[发明专利]一种肺炎链球菌致死性定量评估方法

权利要求书

1.一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，用1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50的肺炎链球菌细菌原液，采用液相肺炎链球菌荚膜染色法进行染色，制备得到不同浓度的染色菌液；

步骤S2，使用蒸馏水调零，对步骤S1中多组不同浓度的染色菌液分别进行比色，测定619nm波长处的吸光度，绘制标准曲线；

步骤S3，将待测样本进行液相肺炎链球菌荚膜染色处理，获得的染色菌液在619nm波长条件下比色，将比色得到的吸光度值在标准曲线上找出对应的LD50数量，得到该样本的致死性量度。

2.根据权利要求1所述的一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，其特征在于，步骤S1和步骤S3中，液相肺炎链球菌荚膜染色法包括如下步骤：

将肺炎链球菌菌液在5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；

向菌体沉淀物中加入7％孔雀绿水溶液10ml，轻柔搅匀，在37℃染色20分钟；5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；

向菌体中加入生理盐水10ml,5000转/分条件下离心2分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；

向菌体沉淀物中加入2ml生理盐水，轻柔搅匀，获得染色菌液。

3.根据权利要求1所述的肺炎链球菌致死性定量评估方法，其特征在于，1LD50浓度的肺炎球菌＝6.42×10⁸CFU/mL,2LD50浓度的肺炎球菌＝1.28×10⁹CFU/mL,3LD50浓度的肺炎球菌＝1.93×10⁹CFU/mL,4LD50浓度的肺炎球菌＝2.57×10⁹CFU/mL,5LD50浓度的肺炎球菌＝3.21×10⁹CFU/mL。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的肺炎链球菌致死性定量评估方法，其特征在于，步骤S1中，不同浓度的细菌原液采用如下方法制备得到：

制作培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，加水1000ml，加热溶解，调pH至7.5，在103.4kPa压力下灭菌20分钟；以无菌操作按10％浓度加入无菌兔血清，制备得到血清肉汤培养基；

制作肺炎链球菌培养液：接种处于对数生长期的肺炎链球菌于血清肉汤培养基中，混匀，在37℃培养箱中培养24小时；

制作不同浓度的细菌原液：将肺炎链球菌肉汤培养液在5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；通过稀释法，制备5个不同浓度的细菌原液，分别是1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50。