[发明专利]一种裂殖壶菌CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用

说明书

本发明涉及一种裂殖壶菌CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用。所述基因编辑系统在pBS‑Zeo质粒中引入调控元件得到，所述调控元件包括裂殖壶菌P_A8047启动子调控的Cas9蛋白、裂殖壶菌内源性核定位信号、终止子T_A8047和由裂殖壶菌P_U6‑2启动子调控的sgRNA转录盒。本发明的基因编辑系统可以实现在裂殖壶菌体内的高效基因编辑。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是一种涉及裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用。

背景技术

裂殖壶菌是一种高产DHA的海洋真菌，因其生长速率快，发酵产生的油脂中不饱和脂肪酸成分简单，DHA含量高而成为研究的热点。裂殖壶菌主要通过PKS和FAS两种途径来分别合成饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，目前通过菌种选育、培养基优化和发酵调控来提高裂殖壶菌中不饱和脂肪酸的含量已经陷入瓶颈，需要对裂殖壶菌胞内脂肪酸合成途径的关键酶及调控因子进行深入研究，而裂殖壶菌遗传转化体系是研究代谢机制的重要手段。因此，亟需一个高效且可以实现多重编辑的工具，来实现裂殖壶菌体内多重基因编辑。CRISPR/Cas9系统是一种新兴基因编辑工具，具有脱靶率低、操作简便、可实现多重编辑等优点而被广泛应用。

目前，针对裂殖壶菌的基因改造，国内外学者主要采用同源重组的方法进行基因的过表达或者敲除，比如专利201710327363.X基于同源重组的方法，将用来自希瓦氏菌PKS酶中的酰基转移酶功能域替换裂殖壶菌PKS酶中的酰基转移酶功能域，提高了菌种中的EPA含量；专利201710747980.5和专利201710078025.7同样采用同源重组技术分别在裂殖壶菌中过表达丙二酸单酰转移酶基因和敲除酮基合成酶，最终调控了菌种的油脂积累和脂肪酸合成，但是同源重组的方法，效率不高。近年来，CRISPR/Cas技术在基因编辑方面的成就十分显著，被广泛应用于基因编辑领域。CRISPR/Cas系统是存在于细菌和古菌中的防御系统，用以免疫噬菌体以及外源DNA的入侵。CRISPR/Cas系统由重复的间隔序列（clusteredregularly interspaced short palindromic repeats）和CRISPR相关基因（cas）组成。根据菌种的不同，重复的间隔序列由多个21~48 bp回文重复序列和 26~72 bp重复序列间非重复间隔序列组成。当外源 DNA 第一次入侵细菌时，Cas核酸酶可在sgRNA的引导下与外源序列结合并切割DNA双链，产生新的间隔序列并插入至已有的间隔序列中。若相同DNA再次入侵，CASCADE 复合体识别，结合和剪切之，特异性降解外源DNA。但是目前，Crispr/Cas9的基因编辑方法在裂殖壶菌中未广泛应用，为提高裂殖壶菌的基因编辑效率，本发明构建了裂殖壶菌的CRISPR/Cas9基因编辑系统，并成功敲除了裂殖壶菌尿嘧啶合成途径的酶，得到一株尿嘧啶缺陷型的菌株，为后续的裂殖壶菌在合成生物学中的应用提供了技术指导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9的应用于裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）的高效基因编辑系统，有效解决该重要产油微生物遗传改造困难的问题。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种应用于裂殖壶菌的CRISPR/Cas9基因编辑系统，在pBS-Zeo质粒中引入调控元件得到，所述调控元件包括裂殖壶菌P_A8047启动子调控的Cas9蛋白、裂殖壶菌内源性核定位信号、终止子T_A8047和由裂殖壶菌P_U6-2启动子调控的sgRNA转录盒。