[发明专利]一种裂殖壶菌CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用

权利要求书

1.一种裂殖壶菌CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，在pBS-Zeo质粒中引入调控元件得到，所述调控元件包括裂殖壶菌P_A8047启动子调控的Cas9蛋白、裂殖壶菌内源性核定位信号、终止子T_A8047和由裂殖壶菌P_U6-2启动子调控的sgRNA转录盒。

2.如权利要求1所述的一种裂殖壶菌CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的P_A8047启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的T_A8047终止子的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

3.如权利要求1所述的一种裂殖壶菌CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的Cas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的裂殖壶菌内源性核定位信号的核苷酸系列如SEQ ID NO：4所示。

4.如权利要求1所述的一种裂殖壶菌CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA转录盒包括P_U6-2启动子、sgRNA识别的靶序列以及gRNA scaffold。

5.如权利要求4所述的一种裂殖壶菌CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述P_U6-2启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述sgRNA scaffold的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。

6.如权利要求1所述的一种裂殖壶菌CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，还包括SV40核定位信号，所述SV40核定位信号与裂殖壶菌内源性核定位信号分别连接Cas9蛋白的两端。

7.权利要求1~6任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将P_A8047启动子、裂殖壶菌内源性核定位信号、Cas9蛋白基因、终止子T_A8047重组连接至pBS-Zeo载体构建重组载体pBS-Cas9；

（2）将步骤（1）构建好的重组载体pBS-Cas9单酶切后与裂殖壶菌P_U6-2启动子调控的sgRNA转录盒重组连接构建CRISPR/Cas9重组载体；

（3）将步骤（2）构建好的CRISPR/Cas9重组载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养后提取重组质粒DNA，即为所述CRISPR/Cas9基因编辑系统。

8.如权利要求7所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，将构建好的CRISPR/Cas9重组载体通过热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

9.如权利要求7所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，培养方式如下：

单菌落挑取于50mL LB液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养，过夜培养12小时，利用AXYGENE质粒小提试剂盒提取后得到重组载体质粒DNA。

10.权利要求1~6任一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在裂殖壶菌基因编辑中的应用。