[发明专利]一种用于构建先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用

说明书

本发明公开了一种用于构建先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用。猪RPE65基因的gRNA，序列如SEQ ID NO.23所示。一种用于猪RPE65基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含本发明所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体。所述的Cas9表达载体为pU6gRNA eEF1a‑mNLS‑hSpCas9‑EGFP‑PURO。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。本发明为先天性黑蒙症猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于针对该病的治疗及病理研究具有重大应用价值。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，涉及一种用于猪RPE65基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其应用,具体涉及猪RPE65基因的gRNA靶点和CRISPR/Cas9系统，及其在构建RPE65基因敲除或插入的先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞中的应用。

背景技术

先天性黑蒙症(Leber congenital amaurosis,LCA)，又称遗传性先天性视网膜病、-Olsen综合征等，是发生最早、最严重的遗传性视网膜病变，占遗传性视网膜病变的5％以上，是导致儿童先天性盲的主要疾病(占10％-20％)，每10万名新生儿中有2至3名患病，大多为常染色体隐性遗传性疾病。

通过基因组扫描、候选基因技术和连锁分析等方法确认了20余种与先天性黑蒙症相关的致病基因，其中RPE65基因研究的最为深入。RPE65基因编码类视黄醇异构水解酶(Retinoid isomerohydrolase)，此酶的主要功能是结合全反式视黄酯，使之转化为11-顺-视黄醛，进而合成为视紫红质来维持视网膜色素再循环的过程。因此，当RPE65基因失去功能，视网膜的光感受细胞就会因缺乏视紫红质而不能对光发生反应，导致视力丧失。在所有的先天性黑蒙症病例中，RPE65基因突变导致的病例大约占15％，而传统医疗手段对此类遗传性疾病没有作用，因此迫切需要与人类疾病相似的动物模型开展新的治疗方法研究。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，且猪体型大小和生理功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的胚胎干细胞注射到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。如在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得纯合突变后代的概率非常低(低于5％)，需要进行后代的杂交选育，这不太适用于妊娠期较长的大动物 (如猪)模型制作。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供猪RPE65基因的gRNA靶点、gRNA，及gRNA 表达载体。

本发明的另一目的是提供一种用于猪RPE65基因编辑的CRISPR/Cas9系统。

本发明的又一目的是提供该CRISPR/Cas9系统在构建RPE65基因敲除或插入的先天性黑蒙症模型猪重组细胞中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

猪RPE65基因的gRNA靶点，序列如SEQ ID NO.17所示。

本发明所述的猪RPE65基因靶点的gRNA序列，由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示互补DNA oligo组成。

猪RPE65基因的gRNA，序列如SEQ ID NO.29所示。

一种针对猪RPE65基因的gRNA表达载体，该表达载体表达本发明所述的gRNA。

作为本发明的一种优选，该表达载体含有本发明所述的gRNA序列。