[发明专利]菌丝培养方法及利用其制备和再生原生质体的方法

说明书

本发明公开了菌丝培养方法，包括：将无菌玻璃纸放置于固体培养基的表面上，后将菌丝块接种于所述无菌玻璃纸上，培养，所得菌丝体直接用于原生质体制备。本发明还公开了桦褐孔菌原生质体的制备方法，包括：将无菌玻璃纸平铺在PDA培养基平板上，将桦褐孔菌菌丝接接种于无菌玻璃纸上，培养；从无菌玻璃纸上刮取到培养好的桦褐孔菌菌丝体，酶解并过滤得到桦褐孔菌原生质体。本发明还公开了桦褐孔菌原生质体的再生方法，包括将原生质体涂布于再生培养基上进行再生培养。本发明制得的桦褐孔菌原生质体呈均一球状，质量高。本发明在无菌玻璃纸上培养菌丝，无需繁琐操作直接刮取即可直接用于原生质体制备，不易污染，易于操作。

技术领域

本发明属于食药用菌育种领域，涉及一种菌丝培养方法，特别涉及利用菌丝培养方法制备及再生原生质体的方法。

背景技术

桦褐孔菌(Inonotus obliquus(Fr.)Pilat)为层菌纲，非褐菌目，多孔菌科，褐卧孔菌属药用真菌，常生长在桦树、杨树等树种上，主要分布在芬兰、波兰、俄罗斯、我国大小兴安岭、长白山区、日本北海道及北美北部等高纬度寒冷地区(Fradj等，2019)。作为一种珍稀药用菌，桦褐孔菌广泛应用于抗肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病等治疗(Patel，2015；.Burmasova等，2019)。然而，桦褐孔菌野生资源有限，自然条件下不易形成子实体，野生菌核产量低；人工栽培形成菌核产量也较低(Balandaykin等，2015；贺紫薇等，2020)。因此，随着桦褐孔菌市场需求增加，采用菌丝体培养替代野生菌核应用可缓解桦褐孔菌野生资源的不足。桦褐孔菌中主要活性成分为多糖类、三萜类、多酚类、生物碱类等化合物，为了提高桦褐孔菌中活性成分的产量，选育出性状优良的高产菌株对进一步开发利用具有重要的意义。在食药用菌育种中，制备优质的原生质体是关键步骤，是完成菌种诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种的基础。桦褐孔菌由于不易形成子实体，很难获得孢子，因此，制备优质的原生质体在桦褐孔菌的育种中尤为重要。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明另有一个目的是提供一种菌丝培养方法。

本发明还有一个目的是提供一种桦褐孔菌原生质体的制备方法。

本发明再有一个目的是提供一种桦褐孔菌原生质体的再生方法。

为此，本发明提供的技术方案为：

菌丝培养方法，包括如下步骤：将无菌玻璃纸放置于固体培养基的表面上，将菌丝块接种于所述无菌玻璃纸上，培养，所得菌丝体直接用于原生质体制备。

桦褐孔菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将无菌玻璃纸平铺在PDA培养基平板上，将桦褐孔菌菌丝接接种于所述无菌玻璃纸上，培养6-10天；

步骤二、从所述无菌玻璃纸上刮取到培养好的桦褐孔菌菌丝体，酶解分离得到桦褐孔菌原生质体。

优选的是，所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法中，步骤一中，获取所述桦褐孔菌菌丝的方法包括如下步骤：已长满桦褐孔菌的PDA培养基平板边缘生长的菌丝用打孔器打孔获取到带有桦褐孔菌菌丝块，将所述菌丝块接种于所述无菌玻璃纸上。

优选的是，所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法中，步骤二中，酶解的方法包括如下步骤：将培养好的桦褐孔菌菌丝体刮取，加入混合酶解液后于温度32-35℃和转动条件100rpm下，酶解3-4h。

优选的是，所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法中，所述混合酶解液包括质量比1-3:1的溶壁酶和蜗牛酶，混合酶解液的浓度为20-30mg/ml。

优选的是，所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法中，步骤二中，分离的方法包括如下步骤：所得酶解液通过若干层擦镜纸过滤后离心，沉淀即为所述桦褐孔菌原生质体。