[发明专利]一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3D凝胶载体及多细胞球培养方法

说明书

本发明公开了一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3D凝胶载体及多细胞球培养方法，本方法与传统不同，本发明通过控制抗/促细胞粘附成分的比例，基于PEGDA/GelMA粘附位点控制材料表面的细胞粘附位点密度，使细胞存在于有限粘附的微环境之中，自组织形成多细胞球，最大程度的模拟了肿瘤细胞组织的生理作用及其环境，更接近真实生物环境最终自组织形成多细胞球。

技术领域

本发明属于生物医学工程技术领域，尤其涉及3D肿瘤细胞成球技术。

背景技术

药物筛选是指利用适当的筛选方法和技术，建立合适的筛选模型，从可能作为药物使用的天然或合成化合物中得到高效的先导化合物，对其进行药理及药效活性的检测，评价某一化合物的药用前景的方法，是新药研发中缩短时间、减少成本和降低风险的关键步骤。传统的细胞筛选模型所利用的细胞通常是由病理部位细胞通过细胞培养等手段得到的单层细胞或单细胞的悬浮液，呈平面生长，缺乏细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的接触，细胞所处的环境与实体微环境截然不同。同氨基酸的盘曲折叠形成不同构象的蛋白质功能不同一样，细胞的堆积方式不同，它的特性也不尽相同，通过普通的平面2D细胞筛选得到的结果不能非常准确地反应药物在人体内的作用效果。例如，多年来癌症药物的发现主要是基于它对癌细胞的杀伤能力和精确抑制癌细胞基因的能力，这些化合物在使肿瘤部分或完全消退的同时，会伴随着大量的细胞毒性累积。而利用2D筛选模型得到的抗癌药物在杀灭病理细胞之后，积累的毒性可能会转而攻击周围的正常细胞。这使得大部分的抗癌药物后期都无法通过临床试验，浪费了大量的人力、物力与时间。所以，2D细胞筛选模型已经无法满足人们的需要。随着组织工程学的发展，人们致力于开发能更好地代表体内生物学的3D培养技术培养肿瘤模型，同时更趋向于大批量和小型化。

现有主流的体外药效的评价方法是采用3D肿瘤成球技术，其依赖于通过剥夺细胞与培养皿间的粘附，迫使肿瘤细胞被动成球(如图1所示)，但该方法存在以下缺陷：(1)一些细胞只能形成松散的聚集体，而不能形成具有生理屏障的多细胞球，因此某些肿瘤细胞无法实现真正的三维培养。(2)这种方法给细胞提供的无粘附微环境在体内并不常见，无法真实模拟体内环境。(3)整个人体内的细胞外基质有很大差异，从细胞外环境的结构和生化组成来看，是每个器官高度特异性，因此无法真实模拟体内细胞和细胞外基质的相互作用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的就是提供了一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3D凝胶载体及多细胞球培养方法，

为解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3D凝胶载体，通过以下方法制备获得：

首先，将交联剂BIS、抗细胞粘附组分A和促细胞粘附组分B，加入PBS溶液中，然后加入交联引发剂，在振荡或搅拌条件下水浴加热至50-60℃完全溶解得到水凝胶溶液；

然后，将水凝胶溶液注入透明模具中，控制温度在20-35℃，进行波长为405nm的光照，发生固化反应得到3D凝胶；

最后，将得到3D凝胶浸入PBS溶液中，并通过环氧乙烷进行灭菌处理，备用；

所述抗细胞粘附组分为PEGDA、丙烯酰胺或聚乙烯醇；所述促细胞粘附组分为GelMA、丙烯酰氨基胶原、丙烯酰氨基纤维蛋白原。

进一步的，所述交联引发剂为LAP。

本发明还提供了一种结直肠癌细胞LOVO的多细胞球培养方法，将结直肠癌细胞LOVO 以0.1-0.2X10⁶的密度接种在上述3D凝胶载体的表面，并置于培养液中，在温度为37±2℃， 4-5％二氧化碳浓度的环境下进行培养，每两天更换一次培养液，培养至少7天后，完成多细胞球结构培养；其中，在制备3D凝胶载体过程中，水凝胶溶液中添加的PEGDA、GelMA和交联剂BIS的质量比分别为10％、10％、0.5％。