[发明专利]一种Msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用

权利要求书

1.一种Msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用，其特征在于：先通过体外细胞系结合体内建立胃癌细胞的PDTX裸鼠模型，再通过干扰和过表达Msi1蛋白来确定Msi1蛋白在治疗胃癌制剂发展中的作用。

2.根据权利要求1所述的一种Msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用，其特征在于：所述胃癌细胞选用的是MKN45、HGC27细胞，PDTX裸鼠模型源自外科手术取下胃癌肿瘤组织移植到免疫缺陷的小鼠体内。

3.根据权利要求1所述的一种Msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用，其特征在于：所述Msi1蛋白在恶性肿瘤细胞中表达异常，并且在介导肿瘤细胞的增殖，引起胃癌细胞对化疗耐受；在过表达Msi1后两种胃癌细胞的抗凋亡能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均增强，而干扰Msi1后两种胃癌细胞的抗凋亡能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均被抑制，含有Msi1的用于治疗胃癌制剂有效抑制肿瘤细胞的发展。

4.根据权利要求3所述的一种Msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用，其特征在于步骤为：

第一步，胃癌细胞凋亡能力的检测：收集转染了过表达Msi1、干扰Msi1质粒的胃癌细胞，并用预冷的PBS清洗一遍；计数5x10⁵个细胞，重悬于100ul的PBS缓冲液；于上述PBS缓冲液中加入5ul的Annexin V和5ul的7-AAD，室温避光孵育15min；加入400ul的荧光SA-FLOUS溶液，置冰上避光保存，1h内上机检测；结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能；细胞膜有损伤的细胞的DNA被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生；因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号；正常活细胞与此相似；过表达Msi1后两种胃癌细胞的凋亡数量明显下调，而干扰Msi1后两种胃癌细胞的凋亡比例明显上调；

第二步，胃癌细胞增殖能力检测：将转染过表达Msi1、干扰Msi1质粒的胃癌细胞48h后种植在96孔板，每组做三个复孔，每孔培养基为100μl，细胞数为5000个；种植后24小时，每孔加入20μlMTT，37℃、5％CO₂，饱和湿度条件下培养4h；吸去培养基，加入150μlDMSO，避光置于摇床上5r/min、振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪A570nm处双波长测得OD值；OD值在0.8-1.2，OD越大说明细胞数量越多可以反映细胞的增殖能力较好，过表达Msi1后两种胃癌细胞的OD值明显高于其他组，说明增殖能力明显变强；干扰Msi1后两种胃癌细胞的增殖能力收到抑制；

第三步，胃癌细胞迁移和侵袭能力的检测：提前一天将基质胶铺在tanswell小室内，放置37℃培养箱内待用；收集转染过表达Msi1、干扰Msi1质粒的胃癌细胞，并于PBS缓冲溶液中调整细胞浓度为10⁵个/ml，接种100ul细胞悬液于transwell上层小室内；下层放置含10％FBS胎牛血清的完全培养基；24h后取出小室并用PBS清洗两遍，加入4％甲醛溶液室温固定20分钟；PBS清洗3遍，对tranwell小室的下层膜结晶紫染色5分钟；PBS清洗3遍，晾干后显微拍照；通过计算吸附在膜下层的细胞数量即穿过膜的细胞数量来反应细胞迁移和侵袭能力，细胞数量越多细胞迁移和侵袭能力越强，反之，细胞迁移和迁移能力弱，过表达Msi1后穿过transwell膜的胃癌细胞数量明显多于其他组，说明迁移和侵袭能力明显变强；干扰Msi1后穿过transwell膜的胃癌细胞数量明显低于其他组，说明迁移和侵袭能力受到抑制；

第四步：体外细胞实验表明，干扰Msi1制备用于治疗胃癌制剂可以有效抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移以及促进凋亡，从而阻止胃癌细胞的进一步生长，在制备用于治疗胃癌制剂的发展进程中发挥着重要的作用；

第五步，建立了胃癌的PDTX模型用来评价抑制Msi1在制备用于治疗胃癌制剂中的作用：获取病人胃癌标本前，告知病人获得同意后签署知情同意书，通过外科手术取下癌症患者的肿瘤组织，然后将组织块剪切成2-4mm的碎块，原位移植的方法，将剪切碎的肿瘤组织移植到免疫缺陷的小鼠体内，待受体鼠体内的肿瘤长到1000-1500mm³后进行传代；第一代命名为F0，而随后的几代分别连续编号如F1，F2；在每次进行传代操作的时候取一小块肿瘤组织进行组织学的检测，如HE染色，与从病人体内取出的原代肿瘤的分子和表现进行比较，第3-7代的的胃癌PDTX模型被用于药物评价实验；当移植瘤的瘤体长至100-200mm³,将动物随机分组，每组5-6只，按照组别分别给予①：5-氟尿嘧啶(50mg/kg/day)，灌胃；②：顺铂(6.25mg/kg/day)，灌胃；③：顺铂(6.25mg/kg/day)联合氟尿嘧啶(50mg/kg/day)，灌胃；④:MSI1抑制剂(50mg/kg/day)，腹腔注射；⑤：MSI1抑制剂(50mg/kg/day)+顺铂(6.25mg/kg/day)；⑥：MSI1抑制剂(50mg/kg/day)+5-氟尿嘧啶(50mg/kg/day)，治疗4周；小鼠的体重及肿瘤体积每3-5天测量一次；体积计算方法为：肿瘤体积＝(长径×短径²)/2；评估给药组与对照组的相对肿瘤抑制率，相对肿瘤抑制率(relative tumor growth inhibition,TGI)计算方法为:TGI＝1-T/C,T/C代表给药组的瘤体体积/对照组的瘤体体积；当肿瘤药物处理后体积减小并小于初始体积时,利用肿瘤消退率来评估，Regression％＝100×(TO-Ti)/TO,TO代表治疗前的体积，Ti代表治疗结束时的体积；干扰Msi1联合使用化疗药物可以显著抑制肿瘤的生长，尤其是Msi1抑制联合5-氟尿嘧啶给药效果最为显著；

第六步：干扰Msi1可以有效抑制胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭，促进细胞凋亡，促进化疗药物的敏感，制备用于治疗胃癌制剂。

5.根据权利要求2所述的一种Msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用，其特征在于：所述用于治疗胃癌制剂为MSI1抑制剂、5-氟尿嘧啶、顺铂中的一种或几种组合物。