[发明专利]一种利用葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法

说明书

本发明提供了一种利用新型葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法，步骤为：通过基因工程手段筛选表达新型重组葡萄糖醛酸酶；以甘草酸为底物进行催化反应，得到纯度较高的甘草次酸；在磷酸盐缓冲溶液环境下，将β‑葡萄糖醛酸酶、Fe₃O₄@Zr‑2MIm孵育得到固定化酶；用固定化酶和甘草酸进行催化反应，得到甘草次酸。本发明中筛选出的β‑葡萄糖醛酸酶催化活性高，在2h内就能够将甘草酸快速完全的转化，且不会产生中间产物单葡萄糖醛酸甘草次酸，方便得到高纯度的甘草次酸。同时本发明的固定化酶可以回收再利用，降低了生产成本，工艺简单，经济节约，非常适合于大规模工业化生产。本发明的固定化酶对甘草酸的转化率达到95%以上，底物甘草酸基本完全转化成甘草次酸。

技术领域

本发明属于催化剂领域，特别涉及一种利用新型葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法。

背景技术

β-葡萄糖醛酸酶(KAE)，存在于人体各组织和体液中，是一种可以水解葡萄糖醛酸苷酸性水解酶。在肝组织中含量最多，在促进细胞增殖中起重要作用。正常人血清中该酶活性最低，随着细胞增生变化，其活性逐渐升高，至发生癌变时活性显著升高。β-葡萄糖醛酸酶作为一种体内酶标志，是与肝癌的发生发展相关的体内活性酶，可能成为肝癌诊断的辅助指标。虽然人类的β-葡萄糖醛酸酶在疾病中发挥重要作用，但人类存在的大多数β-葡萄糖醛酸酶位于微生物群中。事实上，肠道微生物组编码了数千种糖基水解酶，而人类基因组编码的只有97种。近些年，以酶为基础的快速检测技术发展趋于成熟，人们实现了对通过对β-葡萄糖醛酸苷酶活性的近实时监测，用于农村地表水微生物水质在线监测。

甘草属于豆科植物，具有明显的抗炎，抗溃疡作用和抗变态反应作用；近年的药理研究发现甘草还具抗肿瘤，抗爱滋病毒的活性。大量研究证明，甘草酸的药理活性主要归因于甘草的主要成分甘草酸和甘草次酸及其衍生物。甘草酸作为一种天然糖苷类化合物，同其他天然的糖苷类物质一样，不易溶于水，而且由于在C3位连接2个葡萄糖醛酸，极性较强，不能有效透过疏水性的细胞膜，降低了在细胞中的浓度，限制了甘草酸在细胞内发挥药效，不能更好的应用在一些药物治疗上。因此，需要通过定向改造它们的结构，来提高其衍生物的活性。研究表明甘草酸的糖链对其生理功能有着重要影响。如果去掉甘草酸的2个葡萄糖醛酸，则生成甘草次酸，其抗炎，免疫调节，抗肝损伤，抗病毒，抗肿瘤等生理活性相比于甘草酸有明显的增强。

现存的β-葡萄糖醛酸酶大部分会断裂甘草酸的两个糖链，导致中间产物单葡萄糖醛酸甘草次酸的生成，使最终产物不纯。且游离酶的大量使用造成生产成本过高，不利于工业化应用，因此寻找一种能够高效快速的将甘草酸直接转化为甘草次酸的新型β-葡萄糖醛酸酶，具有极高的工业利用价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种新型葡萄糖醛酸酶，并利用其固定化酶生物催化制备甘草次酸，避免中间产物单葡萄糖醛酸甘草次酸的生成，同时利用固定化酶可回收再次利用的特点，降低生产成本。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用新型葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法，包括以下步骤：

1)通过与现存β-葡萄糖醛酸酶进行同源度比对，筛选出一种来自于伯氏曲霉的β-葡萄糖醛酸酶，所述的β-葡萄糖醛酸酶是由NCBI数据库中基因编号为KAE8374379.1的基因序列所编码，通过基因工程手段将所述基因导入大肠杆菌表达得到β-葡萄糖醛酸酶；

2)在磷酸盐缓冲液中，用Fe₃O₄@Zr-2MIm载体固定步骤1)获得的β-葡萄糖醛酸酶，得到固定化酶Fe₃O₄@Zr-2MIm@KAE；

3)利用步骤2)得到的固定化酶催化甘草酸生成甘草次酸。