[发明专利]一种利用葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法

权利要求书

1.一种利用葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)通过与现存β-葡萄糖醛酸酶进行同源度比对，筛选出一种来自于伯氏曲霉的β-葡萄糖醛酸酶，所述的β-葡萄糖醛酸酶是由NCBI数据库中基因编号为KAE8374379.1的基因序列所编码，通过基因工程手段将所述基因导入大肠杆菌表达得到β-葡萄糖醛酸酶；

2)在磷酸盐缓冲液中，用Fe₃O₄@Zr-2MIm载体固定步骤1)获得的β-葡萄糖醛酸酶，得到固定化酶Fe₃O₄@Zr-2MIm@KAE；

所述Fe₃O₄@Zr-2MIm载体的制备方法为：将磁性Fe₃O₄在PVP溶液中超声悬浮，随后加入二甲基咪唑溶液，继续超声，最后在搅拌下缓慢加入硝酸锆溶液，静置后分离沉淀，干燥后得到固定化载体Fe₃O₄@Zr-2MIm，所述PVP溶液、二甲基咪唑溶液、硝酸锆溶液的溶剂均为水/甲醇/乙醇混合液；

3)利用步骤2)得到的固定化酶催化甘草酸生成甘草次酸；催化反应的温度为40℃～60℃，时间为2h～6h，pH值为4.5～5.5。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述基因工程手段的具体方法包括：首先利用PCR对基因进行扩增，而后采用酶切连接手段将其导入表达载体质粒peT28a，通过大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达；

其中PCR扩增的引物为：

引物KAE-F：5’-GGGAAAGGATCCATTCCGACCGATGCGCAGA-3’

引物KAE-R：5’-GGGAAAGTCGACCTGGCACGCCTGGCCTTC-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠和柠檬酸混合液，pH值为7.0～8.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中β-葡萄糖醛酸酶的浓度为0.5mg/mL～2.5mg/mL；Fe₃O₄@Zr-2MIm载体量为2mg～6mg；固定化温度为20℃～40℃，固定时间12min～45min，固定环境为金属浴振荡600rpm～800rpm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述固定化酶催化甘草酸制备甘草次酸的具体步骤为：称量甘草酸溶解于醋酸-醋酸钠缓冲液中，形成甘草酸溶液，加入吸去上清磷酸盐缓冲液的固定化酶Fe₃O₄@Zr-2MIm@KAE中，摇床反应后通过离心将上清分离，沉淀即为产物甘草次酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)所述甘草酸在醋酸-醋酸钠中的浓度为1mg/mL～3mg/mL。