[发明专利]一种猪链球菌疫苗重组蛋白GSE及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用作猪链球菌疫苗的重组蛋白GSE，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

2.编码如权利要求1所述的重组蛋白GSE的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

3.如权利要求1所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

⑴B细胞和辅助T细胞抗原表位筛选；

⑵B细胞和辅助T细胞抗原表位串联基因设计及质粒构建；

⑶重组蛋白的原核表达和纯化，即得猪链球菌疫苗重组蛋白GSE。

4.根据权利要求3所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴的具体方法为：根据猪链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶、烯醇化酶、DNA核酸酶的氨基酸序列，应用生物信息学软件，分析蛋白质一级结构，在抗原表位筛选时排除跨膜区域和信号肽区域，而后预测B细胞和辅助T细胞抗原表位，最后分析蛋白质的二级结构以进一步验证筛选出的抗原表位是否处于抗原性和亲水性的区域。

5.根据权利要求4所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：所述分析蛋白质一级结构所用方法为TMHMM工具和SignalP工具，预测B细胞抗原表位采用ABCpred和BepiPred方法，预测辅助T细胞抗原表位采用在线工具RANKPEP和SYFPEITHI，分析蛋白质的二级结构则使用SOPMA和DNASTAR软件。

6.根据权利要求3所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵的具体方法为：将步骤⑴获得的所述B细胞和辅助T细胞表位的片段，按GAPDH-SsnA-Enolase的顺序依次进行拼接，完成后在重组多肽的N端添加树突状细胞靶向肽序列，各片段间用4个甘氨酸短肽进行分割，完成重组蛋白氨基酸序列的设计；最后在序列两端添加酶切位点，获得编码所述重组蛋白的核苷酸序列，进而构建包含目的基因的重组原核表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：添加的树突状细胞靶向肽序列为SEQ ID NO.3；

或者，所述序列两端添加的酶切位点分别为BamH1和XhoI；

或者，所述重组原核表达载体为pET-28a-GSE。

8.根据权利要求3所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：所述步骤⑶的具体方法为：

将步骤⑵获得的所述原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中，经鉴定后用IPTG作为诱导剂在最适的表达条件下表达，并采用His镍柱纯化的方法纯化重组蛋白；

其中，所述最适的表达条件为：诱导剂IPTG终浓度1mmol/L，37℃下诱导，设置转速180rpm，诱导时间6h。

9.根据权利要求3至8任一项所述的重组蛋白GSE的制备方法，其特征在于：所述猪链球菌疫苗重组蛋白GSE还经过如下处理：

重组蛋白GSE的细胞毒性检验；

具体方法为：

将细胞悬液接种到96孔板，预培养24h，再将步骤⑶获得的纯化后的重组蛋白梯度稀释，加到96孔板中，按蛋白浓度设置7个实验组，终浓度分别为500μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml，并设置对照组，继续培养24h，加入CCK8溶液计算细胞存活率。

10.如权利要求1所述的重组蛋白GSE在制备用于预防猪链球菌病的疫苗方面中的应用。