[发明专利]一种大豆褐斑病病原菌QoI杀菌剂抗性的快速检测方法

说明书

本发明公开了一种大豆褐斑病病原菌QoI杀菌剂抗性的快速检测方法，属于微生物鉴定领域。本发明通过分离培养大豆褐斑病病原菌，前处理后提取其基因组DNA，PCR扩增其细胞色素b基因序列，之后使用错配扩增突变分析PCR技术，利用设计的特异性引物检测扩增得到的细胞色素b基因中的抗性突变，构建了一种方便快速检测大豆褐斑病病原菌QoI杀菌剂抗性的方法。本发明所述方法可快速有效地筛选QoI抗性突变菌，并有可能在将来被改进以检测其他突变体。

技术领域

本发明涉及微生物鉴定领域，特别是涉及一种大豆褐斑病病原菌QoI杀菌剂抗性的快速检测方法。

背景技术

大豆褐斑病是由大豆壳针孢菌(Septoria glycines)引起的，会造成大豆的产量损失，在日本、大西洋南部和中部沿海国家以及所有中北部国家、巴西、加拿大、中国、德国、意大利、韩国和巴基斯坦均有出现。它广泛分布于大豆产区，是美国大豆的一种常见叶面病害。褐斑病的管控主要依靠杀菌剂，包括处理种子和在整个生长季节中多次在大豆叶面施用。QoIs的作用是结合细胞色素bc1酶复合物的醌氧化位点，从而干扰ATP的生成，从而导致敏感真菌的能量不足。细胞色素b是构成线粒体bc1复合体核心的膜蛋白，由细胞色素b(cytb)基因编码。细胞色素b基因上编码单个氨基酸的三个位点的突变能够使病原菌对QoI杀菌剂产生不同程度的抗性，即129位的苯丙氨酸变为亮氨酸(F129L)，137位的甘氨酸变为精氨酸(G137R)，143位的甘氨酸突变为丙氨酸(G143A)。F129L和G137R突变被认为是较低水平的抗性因子，与基线反应相比，其范围在5到15倍之间。而G143A位点突变通常能够产生100倍以上的抗性，与其他两个突变位点相比，其抗性水平要高得多。QoI杀菌剂是最有效的杀菌剂，但因为其产生抗药性风险较高，因此检测QoI杀菌剂的耐药性至关重要。

在过去的研究中，自1915年大豆褐斑病首次报道以来，苯并咪唑氨基甲酸甲酯(MBC)、吡咯菌素、偶氮菌酯、三唑类、氟三醇和戊唑醇等杀菌剂一直被用于控制褐斑病的严重程度。根据现有研究，苯并咪唑氨基甲酸甲酯(MBC)、吡咯菌素(Pyracrostrobin)和嘧菌酯(Azoxy strobin)杀菌剂苯诺美酯(Benomyl)可显著降低处理后地块的褐斑严重程度，而在R3或R5期施用的三唑、氟三醇和戊唑醇并没有显著降低褐斑的程度。然而，目前还没有更多关于大豆褐斑病菌对QoI杀菌剂的敏感性的报道，其对QoI类杀菌剂的高抗药性尚未被鉴定。目前，在田间条件下大多数真菌对QoI的抗性监测是通过杀菌剂改良培养基上的离体孢子萌发试验来进行的。这种分析非常费时费力。分子技术利用与杀菌剂抗性相关的点突变来区分耐药菌株，已发展成为一种快速、准确、可靠检测杀菌剂抗性管理的重要工具。但在大豆褐斑病菌对QoI杀菌剂的敏感性、大豆褐斑病菌的细胞色素b基因序列、QoI抗性菌株突变监测等方面未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆褐斑病病原菌QoI杀菌剂抗性的快速检测方法，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种大豆褐斑病病原菌QoI杀菌剂抗性的快速检测方法，首先分离培养大豆褐斑病病原菌，前处理后提取其基因组DNA，PCR扩增其细胞色素b基因序列，之后使用错配扩增突变分析PCR技术，利用设计的特异性引物检测扩增得到的细胞色素b基因中的抗性突变。

优选的，所述的培养大豆褐斑病病原菌的具体步骤为：大豆壳真孢菌菌株在添加利福平的V8培养基上25℃培养2天，然后在光照12h，黑暗12h的光照条件下培养5天。

优选的，所述的前处理的方法为：将从V8-琼脂表面取出的7天龄的菌丝体和分生孢子转移到含有720ul CLS-VF，80ul浓度为1mg/ul PVP和200ul PPS的2ml裂解基质离心管中，使用匀浆器以6.0速度匀浆2次，每次30s。

优选的，所述的抗性突变为G143A。

优选的，所述的特异性引物包括SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.10所示的引物。