[发明专利]转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用

说明书

本发明公开了一种转氨酶突变体及其制备西他列汀中间体的应用，所述突变体是SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第74位的酪氨酸取代为脯氨酸、第228位的谷氨酸取代为天冬氨酸、第254位的亮氨酸取代为丙氨酸、第290位的蛋氨酸取代为苏氨酸获得的。本发明以含有转氨酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或纯酶作为生物催化剂，以西他列汀中间体前体酮或潜手性羰基化合物为底物，制备西他列汀中间体或西他列汀酯类中间体；本发明方法的总收率约82％，产物e.e.值达到99％。

(一)技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体地说，是转氨酶及其突变体酶在制备光学纯西他列汀中间体中的方法，包括转氨酶、突变体、编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌和重组酶、以及应用。

(二)背景技术

西他列汀(sitagliptin)是由美国Merck公司和Codexis公司研制和开发，是首个获得FDA批准用于治疗Ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制剂。西他列汀能够血糖依赖性地增加胰岛素的分泌，降糖作用较为适中，不会引发低血糖的发生，并且无增加体重、恶心、呕吐等副作用。西他列汀的商品名为捷诺维(Januvia)，目前已在全世界70多个国家批准使用，是国际上药物销售额前20强的药物。

西他列汀及其中间体可由化学-酶法相结合制得，逐步成为合成手性医药化学品及其中间体的首选方案。对于化学-酶法而言关键就是要获得一种转氨酶，其能够催化不对称转氨反应得到光学纯的西他列汀中间体。美国专利US8293507公开了Codexis公司对节杆菌来源的转氨酶(ATA117)进行改造得到的生物催化剂，转氨得到的产物ee值达到99％。

但是目前，对于R-型选择性转氨的天然转氨酶报道很少，且这些转氨酶催化的底物谱较窄，往往是为特定反应筛选的最适生物催化剂，因此大大限制了其应用范围，导致能够用于合成西他列汀中间的酶寥寥无几。随着定向进化技术的发展，蛋白质工程越来越多地被用于改造酶的底物特异性，筛选具有较宽底物谱的新型转氨酶，研究其可以高效高选择性催化的手性药物及其中间体，不仅可以拓宽其应用范围，提升其应用潜力，也为实现工业化生产奠定基础。

(三)发明内容

本发明针对现有生产西他列汀中间体工艺中存在的缺陷(立体选择性不佳、催化剂价格昂贵、溶剂难以回收等问题)，提供了一种转氨酶突变体、编码基因、重组载体、重组基因工程菌，以及在不对称转氨得到西他列汀或西他列汀酯类中间体的应用，该方法原料转化率高、生产成本低、收率高。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种转氨酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第74位的酪氨酸取代为脯氨酸、第228位的谷氨酸取代为天冬氨酸、第254位的亮氨酸取代为丙氨酸、第290位的蛋氨酸取代为苏氨酸获得的，所述转氨酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：4，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

本发明所述转氨酶突变体是将源于分枝杆菌(Mycolici bacterrium)的转氨酶进行突变获得的，所述转氨酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。本发明SEQ ID No:2所示的转氨酶和节杆菌来源的转氨酶ATA117-Rd11(美国专利US8293507)的氨基酸序列一致性仅为42％，具有显著差异性。

本发明还涉及所述转氨酶突变体的编码基因构建的重组载体及所述重组载体转化制备的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌优选按如下方法制备：将转氨酶基因(或者突变体基因)同表达载体pET28b连接，构建了含有转氨酶基因的异源表达重组质粒pET28b-MbTA(或pET28b-MbTAmut1)；将表达重组质粒pET28b-MbTA(或pET28b-MbTAmut1)转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得含有重组质粒pET28b-MbTA的重组大肠杆菌/pET28b-MbTA(或pET28b-MbTAmut1)。