[发明专利]转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用

权利要求书

1.一种转氨酶突变体，其特征在于所述突变体是SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第74位的酪氨酸取代为脯氨酸、第228位的谷氨酸取代为天冬氨酸、第254位的亮氨酸取代为丙氨酸和第290位的蛋氨酸取代为苏氨酸获得的。

2.一种权利要求1所述转氨酶突变体的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

3.一种权利要求2所述转氨酶突变体的编码基因转化制备的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述转氨酶突变体在生物催化西他列汀中间体前体酮合成西他列汀中间体中的应用，其特征在于所述的应用为：以含有转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后提取的纯酶为生物催化剂，以1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度30-45℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述反应体系中，湿菌体用量为10-100g/L，纯酶用量为0.01-1.0 g/L，底物加入终浓度为2～50g/L，二甲基亚砜体积加入终浓度为10-40％，磷酸吡哆醛加入终浓度0.5g/L，异丙胺加入终浓度10g/L。

6.一种权利要求1所述转氨酶突变体在生物催化潜手性羰基化合物合成西他列汀酯类中间体中的应用，其特征在于所述潜手性羰基化合物为下列之一：3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含有转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以潜手性羰基化合物为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度25-35℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀酯类中间体。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述反应体系中，湿菌体用量为10～100g/L，底物终浓度为2～60g/L，二甲基亚砜体积加入终浓度为10-40％，磷酸吡哆醛加入终浓度0.5g/L，异丙胺加入终浓度10g/L。

9.如权利要求4或7所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含有转氨酶突变体编码基因的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD 600 达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，即获得所述的湿菌体。