[发明专利]一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用

说明书

本发明提供一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列，根据单增李斯特菌的特异保守区域为靶标区域设计特异性引物及荧光RAA探针，全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在37℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间，可以实现单管现场、快速检测，具有特异性强、灵敏度高以及检测速度快的优势。

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，尤其是涉及一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用。

背景技术

单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。单增李斯特菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16％，有70％的人可短期带菌，4-8％的水产品、5-10％的奶及其产品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入未充分加热的食品而感染，约占85-90％的病例是由被污染的食品引起的。该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势，单增李斯特菌在食品卫生微生物检验中应引起足够的重视。

目前，单增李斯特菌检测方法包括传统的检测方法、免疫学检测以及分子生物学检测方法等。传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在症状时期检测到细菌的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于单增李斯特菌的检测。目前，国内外已建立的单增李斯特菌检测方法有实时PCR检测方法、半巢式PCR检测方法、LAMP检测方法等，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而LAMP方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用LAMP方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。RAA技术不依赖于PCR仪器的便捷性能，且检测时间较PCR方法或荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至高于，是革命性的技术突破，能充分扩大核酸扩增技术的应用领域。在RAA反应过程中，单增李斯特菌DNA通过利用重组酶代替PCR高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止DNA链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以DNA为模板合成目的产物。反应在39℃下进行20分钟。此外，RAA技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套RAA多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式PCR技术无法相比的。目前，国内外还没有公开用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其试剂盒的相关内容。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高以及检测速度快的用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列，根据单增李斯特菌的特异保守区域为靶标区域设计特异性引物及荧光RAA探针，引物序列具体如下：

正向引物为5'-ACCAGCTGTAACTTTTTCGGTTCAAGCTATG-3'；

反向引物为5'-GTGTGGTTAAATCCAATTGCATGATAATCT-3'；