[发明专利]β-烟酰胺单核苷酸的分析方法

说明书

本发明提供了一种β‑烟酰胺单核苷酸的分析方法。该分析方法包括对含β‑烟酰胺单核苷酸的待测试物进行HPLC分析，其中HPLC分析的色谱柱为Waters XBridge BEH Amide色谱柱，流动相包括乙腈和缓冲溶液，缓冲溶液的pH值为3.0～10.0。本申请首次采用Waters XBridge BEH Amide色谱柱对强极性的β‑烟酰胺单核苷酸的待测试物进行梯度洗脱分析，从而使β‑烟酰胺单核苷酸的出峰时间延后，进而使β‑烟酰胺单核苷酸与各杂质进行有效分离。该方法得到的色谱图中β‑烟酰胺单核苷酸的峰形清晰、重现性好、且该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高等特点。

技术领域

本发明涉及β-烟酰胺单核苷酸的检测技术领域，具体而言，涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的分析方法。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸的分子式为C₁₁H₁₅N₂O₈P，化学结构式如下：

β-烟酰胺单核苷酸是烟酰胺磷酸核糖转移酶反应的产物，也是NAD⁺的关键前体之一。NAD⁺是在全部生物种中的电子传递体，其广泛存在于各种生物体中，对生命活动具有极其重要的作用。而烟酰胺磷酸核糖转移酶参与细胞内β-烟酰胺单核苷酸腺苷化，从而合成NAD⁺，进而满足生命体的能量传递、物质代谢和信号转导等中对NAD⁺的需求。β-烟酰胺单核苷酸在一定程度上可以降低生物细胞的衰老和死亡，减少肿瘤的发生和发展。另外，β-烟酰胺单核苷酸还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。

在产品制备和贮存过程中，对β-烟酰胺单核苷酸有关物质进行监测，对于终产品的生产过程以及产品的质量控制非常重要。

目前有一些与β-烟酰胺单核苷酸的分析相关的专利，如专利申请公开号为CN108949865 A的中国专利申请、专利申请公开号为CN 108697722A中国专利申请，其虽然公开了β-烟酰胺单核苷酸的HPLC分析方法，但是它们均采用C18柱，且β-烟酰胺单核苷酸出峰时间早，使得β-烟酰胺单核苷酸与相邻杂质峰形严重重叠，无法区分。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种β-烟酰胺单核苷酸的分析方法，以解决现有技术中的采用HPLC分析方法难以达到β-烟酰胺单核苷酸与杂质的有效分离的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的分析方法，该分析方法包括对含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物进行HPLC分析，其中HPLC分析的色谱柱为Waters XBridge BEH Amide色谱柱，流动相包括乙腈和缓冲溶液，缓冲溶液的pH值为3.0～10.0。

进一步地，上述乙腈和缓冲溶液的体积比为50～86：14～50，优选缓冲溶液选自甲酸铵缓冲溶液、乙酸铵缓冲溶液、甲酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液中的任意一种或多种。

进一步地，上述HPLC分析的过程包括：将含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物在色谱柱中进行梯度洗脱，梯度洗脱依次包括第一梯度洗脱、第二梯度洗脱和第三梯度洗脱，其中，第一梯度洗脱采用的第一流动相包括体积比为1:4～1:6的缓冲溶液与乙腈，第二梯度洗脱采用的第二流动相包括体积比为1:1～1:2的缓冲溶液与乙腈，第三梯度洗脱采用的第三流动相包括体积比为1:4～1:6的缓冲溶液与乙腈，优选第一梯度洗脱的时间为5～10min，优选第二梯度洗脱的时间为40～55min，优选第三梯度洗脱的时间为100～150min。

进一步地，上述缓冲溶液的pH值为8.0～10.0，优选为9.0。

进一步地，上述HPLC分析的检测波长为254～270nm，优选为265nm。