[发明专利]一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法

说明书

本发明公开了一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法。所述方法包括以下步骤：(1)将待测细菌和双特异性抗体标记的胶体金反应得到细菌‑双特异性抗体胶体金复合物；(2)纯化所述细菌‑双特异性抗体胶体金复合物并溶解于小分子半抗原‑载体偶联物标记的胶体金溶液，得到上样液；(3)将所述上样液滴加至所述胶体金试纸条上进行反应。本发明检测细菌的方法可以在避免细菌聚集的同时提高检测灵敏度，最佳可达2.5×10⁴CFU/mL，且所述双特异性抗体的稳定性高。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法。

背景技术

近年来，由食源性致病菌引发的食物中毒事件已广为关注，引起这些中毒的细菌主要有：大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌以及单增李斯特菌等。这些菌会引起疾病的爆发和流行，给社会带来巨大损失，如肠出血性大肠杆菌O157：H7可产生志贺毒素，能引起出血性肠炎、血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症等疾病。该菌主要通过污染食品、水源进行粪口传播，而且其具有耐胃酸能力强、感染剂量低的特点，有报道称数十个活菌即可造成人畜感染发病。检测细菌的“金标准”需要通过平板计数分离和生理生化鉴定，操作复杂、耗时长。而胶体金免疫层析试纸条方法利用抗原抗体特异性结合反应，具有操作简便、耗时短等特点，因而在微生物、药物残留等多个检测领域被广泛运用。

现有的关于胶体金试纸条检测细菌的方法中，存在如下问题：

1、传统的检测细菌的免疫层析试纸条一般为利用双抗夹心原理的胶体金试纸条方法，由于两个抗体针对细菌的结合位点存在竞争；

2、作为检测探针胶体金标记抗体的Fab存在两个抗原结合片段，发生一个抗体可结合两个细菌从而导致胶体金标记抗体与细菌在金标垫结合反应过程中造成细菌凝聚(这一点已在普通显微镜及扫描电镜下得到验证)，细菌凝聚成较大的颗粒后会导致在试纸条上进行层析时发生堵塞，形成不规则条带，使迁移达到T线的胶体金标记抗体-细菌免疫复合物较少。

由于上述原因灵敏度仅能达到10⁶CFU/mL，但有些细菌如大肠杆菌O157:H7感染致病剂量低，因此传统的检测细菌的免疫层析试纸条的灵敏度亟需改进和提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为解决现有胶体金试纸条检测方法中细菌聚集从而导致试纸层析时发生堵塞、灵敏度不够高、检测所需时间较长等缺陷，提供了一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法。

本发明的发明人通过构思和验证，发现了在胶体金试纸条检测中利用双特异性抗体可以避免细菌聚集并提高检测的灵敏度。其中，所述双特异性抗体的一个抗原结合位点结合所述待测细菌，另一个抗原结合位点结合所述小分子半抗原-载体偶联物。在测试中完全避免细菌聚集，同时检测灵敏度可达2.5×10⁴CFU/mL。另外，本发明所用双特异性抗体的稳定性高，检测结果稳定可靠；灵敏度的提高也带来了检测效率的提升。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法，其包括以下步骤：

(1)将待测细菌和所述双特异性抗体标记的胶体金反应得到细菌-双特异性抗体胶体金复合物；

(2)纯化所述细菌-双特异性抗体胶体金复合物并溶解于小分子半抗原-载体偶联物标记的胶体金溶液，得到上样液；

(3)将所述上样液滴加至所述胶体金试纸条上进行反应；

其中，所述双特异性抗体的一个抗原结合位点结合所述待测细菌，另一个抗原结合位点结合所述小分子半抗原-载体偶联物。

所述待测样品、所述双特异性抗体标记的胶体金和小分子半抗原-载体偶联物标记的胶体金溶液的用量本领域人员可以常规确定，例如可参照本领域中含有单克隆抗体的胶体金试纸条检测。