[发明专利]一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法

权利要求书

1.一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法，其包括以下步骤：

(1)将待测细菌和所述双特异性抗体标记的胶体金反应得到细菌-双特异性抗体胶体金复合物；

(2)纯化所述细菌-双特异性抗体胶体金复合物并溶解于含有小分子半抗原-载体偶联物标记的胶体金和载体的溶液，得到上样液；

(3)将所述上样液滴加至所述胶体金试纸条上进行反应；

其中，所述双特异性抗体的一个抗原结合位点结合所述待测细菌，另一个抗原结合位点结合所述小分子半抗原-载体偶联物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双特异性抗体包括Fab¹-Fc-Fab²结构。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测细菌为革兰氏阴性菌和/或所述小分子半抗原-载体偶联物中小分子半抗原为4-CPAOZ。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)；优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌O157；更优选地，所述大肠杆菌O157为大肠杆菌O157：H7。

5.如权利要求3或4任一项所述的方法，其特征在于，所述小分子半抗原-载体偶联物中载体为BSA或OVA。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述小分子半抗原-载体复合物为4-CPAOZ-BSA，所述待测细菌为大肠杆菌O157：H7。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述双特异性抗体按下述方法制备：

以AOZ为原料，制备4-CPAOZ-BSA作为完全抗原，利用所述完全抗原制备分泌抗4-CPAOZ-BSA抗体的免疫脾细胞；

制备灭活大肠杆菌O157:H7菌体抗原，利用灭活大肠杆菌O157:H7菌体抗原制备抗所述大肠杆菌O157:H7菌体抗原的免疫脾细胞，并利用所述免疫脾细胞制备抗大肠杆菌O157:H7菌体抗原的杂交瘤细胞；

融合所述分泌抗4-CPAOZ-BSA抗体的免疫脾细胞和所述抗大肠杆菌O157:H7菌体抗原的杂交瘤细胞，得到分泌所述双特异性抗体的杂交瘤细胞，从所述分泌双特异性抗体的杂交瘤细胞注射的小鼠腹腔液中提取所述双特异性抗体；

优选地，所述双特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区，编码所述重链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和3所示，编码所述轻链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:2和4所示。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤具体为：

从待测样品中分离出细菌，向分离出的细菌加入所述双特异性抗体标记的胶体金，反应后分离并纯化所得细菌-双特异性抗体胶体金复合物；

将所述细菌-双特异性抗体胶体金复合物溶解于含所述小分子半抗原-载体偶联物的PBST缓冲液中，得到所述胶体金试纸条的上样液；

将所述上样液滴加至所述胶体金试纸条上进行反应；

优选地，所述分离的方法为离心；更优选地，重复所述纯化的步骤；

和/或，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线包被抗所述双特异性抗体的抗体，所述质控线包被抗所述小分子半抗原的抗体。

9.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区，编码所述重链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和3所示，编码所述轻链可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO:2和4所示；优选地，所述双特异性抗体包括Fab¹-Fc-Fab²结构。

10.如权利要求9所述的双特异性抗体在制备用于检测细菌的胶体金试纸条中的应用。