[发明专利]一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用

说明书

本发明实施例公开了一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用，属于生物技术领域。一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：1)培养波氏杆菌菌液；2)在10000g，20min，4℃条件下离心，取上清，滤器过滤；3)使用分子量为100kDa的超滤管在5000g，20min，4℃条件下浓缩，所得浓缩液在100000g，4℃条件下超速离心2h，弃上清，沉淀用TE Buffer重悬，于‑80℃冻存。本发明工艺能够提高OMV的产量，为后续工业化大规模批量生产提供参考。本发明通过体内免疫试验证明OMV以及OMV结合铝佐剂能够诱导动物体特异性免疫保护反应，可用于波氏杆菌疫苗的开发，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用。

背景技术

支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)是一种需氧、高度传染性的革兰氏阴性菌，可引起哺乳动物呼吸道感染，常见于各种家畜和野生哺乳动物的上呼吸道。如造成兔和豚鼠的气管支气管炎(鼻塞)，狗的犬支气管肺炎(犬舍咳嗽)，以及猪的鼻甲萎缩等；还可感染免疫功能低下者(如HIV/AIDS、中性粒细胞减少症、糖尿病、营养不良或移植患者)，造成严重的肺部疾病，甚至危及生命。在规模化养兔场中，波氏杆菌在我国多个省份的兔群中普遍存在，对养殖户造成极大经济损失，已成为兔病防治的一大难题。目前，预防该疾病最有效的措施是接种疫苗。目前市面上，针对兔波氏杆菌的兽用疫苗主要是灭活苗，大部分灭活苗能够引起高血清抗体滴度，但持续时间短，保护率低。由于这种病菌对人类和动物的健康造成重大影响，故亟需研发有效的新型疫苗。

外膜囊泡(Out Membrane Vesicle，OMV)是细菌生长过程中分泌的一种直径介于20～250nm的球形纳米结构，其无生命活性并且不可复制，在不同温度和处理下都能保持完整和稳定，包含蛋白质、DNA、RNA、脂多糖(LPS)、酶和肽聚糖等细菌成分，能够有效引起机体对细菌感染的先天性和适应性免疫应答，使得OMVs成为潜在的新型疫苗候选者。许多研究显示OMVs是有前景的对抗细菌感染疫苗候选者，例如流感嗜血菌、多杀巴斯德菌、霍乱弧菌、产肠毒素的大肠埃希菌、百日咳博代杆菌和鼠伤寒沙门菌。脑膜炎奈瑟菌的外膜囊泡(OMVs)已经成功研发成商品化的疫苗。这充分说明OMVs在疫苗的研发方面，有其独特的优势。我们坚信OMVs对于兔波氏杆菌新型亚单位疫苗的研究将具有积极的意义。

OMV的产生一般是细菌对包膜作用压力的普遍反应，往往由多种生存条件引起。当细菌处于恶劣的环境时，各种应激因素如温度、营养物质的消耗和有害化学物质的暴露均可诱导产生OMV。目前OMV的生产流程都是基于批处理的，具有产量低、成本高的特点，OMV生产在足够的数量，纯度和可重复性仍然是一个关键的挑战。

本研究建立兔波氏杆菌OMV最佳制备工艺，以提高OMV的产量，为后续工业化大规模批量生产兔波氏杆菌OMV提供参考，了解兔波氏杆菌OMV的理化性质及蛋白组成，以期为基于OMV的波氏杆菌疫苗设计提供基础信息和潜在策略。并通过体内免疫试验，探究OMV的免疫增强和抗感染效果。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，本发明提供一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：

1)培养波氏杆菌菌液：将波氏杆菌菌株划线接种于TSA平板，37℃培养36h，挑取单菌落接种于TSB培养基中，37℃、200rpm摇床上培养10h后，按1:100在含有头孢氨苄的TSB培养基中扩大培养；

2)将步骤1)培养获得的菌液，在10000g，20min，4℃条件下离心，取上清，滤器过滤；