[发明专利]一种亚细胞定位表达载体及构建方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种亚细胞定位表达载体及构建方法，在TA载体中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB‑eGFP片段。用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。本发明的亚细胞定位载体既可以用于瞬时转化，研究亚细胞定位，也可以利用农杆菌介导的方法，获得稳定的转基因植株；获得的转基因材料可以用于下一步的生理生化与功能分析。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种亚细胞定位表达载体及构建方法。

背景技术

目前，最接近的现有技术：

近年来，随着植物全基因组测序的快速发展，一大批植物物种完成了参考序列的拼接、组装和注释。对基因进行解析并明确其功能已成为我们了解生命密码的必需步骤。目前植物科学研究中，功能基因研究离不开载体的构建。

目前常用的载体构建方法有Gateway系统的同源重组法、胡向阳研究组开发的TA克隆法以及pCambia系列载体。Gateway系列载体利用载体上面的attR和attL序列，通过同源重组酶，将片段插入到载体中，采用毒性蛋白ccdB和相应的抗生素进行筛选；胡向阳团队开发的TA克隆系列载体，利用非高保真酶扩增得到的PCR产物末端含有突出的碱基A的特点，利用限制性内切酶XcmI切割载体，产生突出的碱基T，然后利用碱基A∷T配对的方式将目的片段插入到载体中。

上述两种方法都极好的利用了毒性蛋白ccdB，以及相应抗生素筛选的方法，所产生的片段均为零背景的目的克隆。但目前同源重组酶的价格相对较高，TA克隆则存在连接效率较低的情况。pCambia系列载体采用的是限制性内切酶连接的方式将目的基因插入到载体中，连接效率高，该方法目前实验中采用的较多。但该系列的载体不含有毒性蛋白，仅采用相应抗生素进行筛选，得到的克隆中，时常存在假阳性，即不能排除空载的情况。

综上所述，现有技术存在的问题是：

（1）目前同源重组酶的价格相对较高，TA克隆则存在连接效率较低的情况。

（2）pCambia系列载体不含有毒性蛋白，仅采用相应抗生素进行筛选，得到的克隆中，时常存在假阳性，即不能排除空载的情况。

解决上述技术问题的意义：

本发明将ccdB毒性蛋白与限制性内切酶位点进行聚合，构建出既含有多个限制性内切酶位点，又含有ccdB毒性蛋白筛选的亚细胞定位载体。该载体既可以用于瞬时转化，研究亚细胞定位，也可以利用农杆菌介导的方法，获得稳定的转基因植株。获得的转基因材料可以用于下一步的生理生化与功能分析。

本发明加快和简化了载体构建的速度，方便基因功能的研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种亚细胞定位表达载体的构建方法。

本发明是这样实现的，一种亚细胞定位表达载体的构建方法，所述亚细胞定位表达载体的构建包括以下步骤：

（1）从TA载体（参考文献Wang, C., et al. (2013). A series of TA-based andzero-background vectors for plant functional genomics）中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB-eGFP片段。

（2）用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。