[发明专利]一种小鼠卵巢颗粒细胞分离、培养及体外损伤模型构建的方法

说明书

本发明公开了一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，主要包含以下步骤：1)注射PMSG促进3‑4周龄的幼年小鼠排卵；2)小鼠卵巢的分离及卵泡破碎：将促排卵48小时的小鼠腹部剖开，取出双侧卵巢，剥离卵巢周围脂肪组织与结缔组织。在显微镜下用1mL注射器针头刺破卵泡释放卵巢颗粒细胞。过200目塞网后放置于15mL离心管中待用；3)0.25％胰酶消化卵巢：将卵泡破碎后的卵巢组织放入0.25％胰酶，置于37℃的水浴锅中消化30分钟，过200目筛网后装入15mL离心管内，离心后便可获得大量纯度较高的卵巢颗粒细胞；4)卵巢颗粒细胞体外化疗损伤模型的构建：用浓度为5mg/mL环磷酰胺(CTX)处理卵巢颗粒细胞24小时，可得到卵巢颗粒细胞化疗损伤模型。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种小鼠卵巢颗粒细胞分离、培养及体外损伤模型构建的方法。

背景技术

卵巢对于女性而言是一个重要的生殖器官，同时也是一个十分重要的内分泌器官。卵巢除了具有排卵的功能外，还具有激素分泌的能力，对于女性维持体内激素水平的平衡至关重要。卵巢颗粒细胞是卵巢内十分重要的功能细胞，卵巢颗粒细胞的增殖与分化将会直接影响着卵泡的发育、生长、闭锁以及激素的分泌，从而影响卵巢的功能。

卵巢早衰是一种严重影响妇女身心健康的卵巢功能性疾病，主要是指由于遗传、免疫缺陷以及医源性(化疗与放疗)等引起的卵巢功能的不可逆损伤。卵巢早衰的特点包括卵巢功能的丧失、卵巢颗粒细胞的凋亡、月经初潮的混乱甚至消失，以及性激素分泌的紊乱。在肿瘤治疗过程中常会运用放疗与化疗手段去治疗肿瘤疾病，研究表明，放疗与化疗对女性卵巢会产生不可逆性的损伤。根据对癌症幸存儿童患者的调查发现，3390名女性儿童中，215人患有卵巢早衰疾病，发病率约为6.3％。在我国，卵巢早衰的发病率约为2.8％，西方国家卵巢早衰发病率约为3.6％。卵巢早衰已经严重影响了癌症治疗幸存女患者的生活质量，尤其对于儿童来说，严重地影响了她们的正常生活。

卵巢颗粒细胞的凋亡被认为是医源性引起卵巢早衰的机制之一，因此通过对于卵巢颗粒细胞的体外研究将可以为人们提供治疗或缓解卵巢早衰的新思路。

到目前为止，人们对于卵巢颗粒细胞的提取方法以及传代后性能的维持还不是很了解。同时化疗药物促使卵巢颗粒细胞凋亡的原因也没有很好的答案。如何获得高纯度、具有较好细胞状态的卵巢颗粒细胞以及选择何种化疗药物何种剂量进行体外损伤实验为体外研究卵巢颗粒细胞的重点。本方法将传统的机械提取法与酶消化法相结合并通过体外激素促排提高卵巢颗粒细胞的纯度以及状态，并选择CTX作为体外损伤模型构建的化疗试剂。

发明内容

针对现有技术的上述不足之处，本发明的目的是提供一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法、并利用免疫荧光成像技术鉴定卵巢颗粒细胞纯度。

本发明的目的之一是提供一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，包括以下步骤：

1)每只3-4周龄的幼年雌性小鼠腹腔注射10IU的PMSG，48小时后剖开小鼠腹腔取出双侧卵巢；将卵巢组织放入预冷的PBS中剥离卵巢周围结缔组织和脂肪组织；

2)将步骤1)的剥离好的卵巢组织放入装有预冷DMEM/F12溶液的10cm培养皿中，置于体式显微镜下用1mL注射器针头刺破卵泡，释放卵巢颗粒细胞释。将细胞悬液溶液过200目筛网后，转移至15mL离心管中；

3)将步骤2)中刺破卵泡后的卵巢组织放入装有0.25％胰酶的15mL离心管中，将离心管置于37℃水浴锅中消化30分钟。然后加入2倍体积的消化终止液终止消化后过200目筛网，将过筛网后的溶液转移入步骤2)中的15mL离心管中；