[发明专利]一种小鼠卵巢颗粒细胞分离、培养及体外损伤模型构建的方法

权利要求书

1.一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取3-4周龄的幼年雌性小鼠，腹腔注射PMSG，置于24℃-26℃、湿度适宜的环境下饲养48小时，48小时候后，麻醉所述小鼠，将其放置于解剖版上，剖开小鼠腹部，取出双侧卵巢，剥离卵巢周围脂肪组织及结缔组织，

2)在体式显微镜下用1mL注射器刺破卵泡，释放卵巢颗粒细胞，细胞悬液过200目筛网后置于15mL离心管中待用；

3)用预热的0.25％的胰酶消化步骤2)所述卵泡破碎后的卵巢组织30分钟，然后终止消化，将消化后的组织过200目筛网，细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清，用卵巢颗粒细胞完全培养基重悬细胞，可得到高纯度卵巢颗粒细胞；

4)将步骤3)中得到的细胞接种在12孔细胞培养板中，然后置入培养箱中培养，吸弃原有卵巢颗粒细胞完全培养基，去除未贴壁细胞，添加新鲜的卵巢颗粒细胞完全培养基，并每孔加入5mg/ml的无菌损伤药物试剂CTX，进行损伤模型的构建。

2.根据权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，所述卵巢颗粒细胞完全培养基具有如下组分：

33.6mL的DMEM/F12基础培养基、6mL的澳大利亚-胎牛血清(AUS-FBS)和0.4mL的双抗溶液；所述双抗溶液含10000U/mL苄青霉素钠和10000μg/mL链霉素。

3.根据权利要求2所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，所述培养的条件为，在12孔细胞培养板中添加1mL卵巢颗粒细胞完全培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养，培养时间为48h；或在6孔细胞培养板中每孔添加2mL卵巢颗粒细胞完全培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养，培养时间为48h。

4.根据权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤3)所述高纯度卵巢颗粒细胞的纯度大于95％。

5.根据权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤3)所述终止消化的方法为用含体积浓度5％-15％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，优选地，采用10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。

6.根据权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤1)所述PMSG的注射剂量为5-10IU，优选地，每只小鼠腹腔注射10IUPMSG。

7.根据权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及体外化疗损伤模型构建的方法，其特征在于，所述的损伤药物试剂CTX浓度为5mg/ml，所述损伤模型构建方法包括以下步骤：

A.用电子天平称取CTX粉末；

B.避光环境下，在无菌超净台中用卵巢颗粒细胞完全培养基溶解CTX粉末；

C.将溶解后的溶液通过0.22um滤器，达到除菌目的；

D.以5mg/ml的剂量加入到细胞培养板中进行损伤细胞；

E.放入到5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养24小时；

F.24小时后在倒置显微镜下观察细胞损伤情况，可发现大部分卵巢颗粒细胞出现凋亡的现象。