[发明专利]一种纤维素发酵工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种纤维素发酵工程菌及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明通过将火球菌纤维寡糖转运蛋白基因连接到载体上后转入表达宿主感受态细胞中并进行诱导表达培养，成功构建了高效表达火球菌纤维寡糖转运蛋白的工程菌株，并通过热力学实验证明了其能够高效结合纤维寡糖，尤其是纤维二糖，为产业上进一步利用纤维素提供了工具。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种纤维素发酵工程菌及其构 建方法和应用。

背景技术

随着化石能源的日趋枯竭以及人们对环境污染、能源危机等问题关注 度的提高，寻找清洁的可再生能源成为当前研究热点。木质纤维素是由多 种有机高分子化合物组成的具有高结晶度和聚合度的复合体，主要由纤维 素、半纤维素和木质素通过共价键和非共价键相互连接形成，因其储量丰 富、成本低廉、清洁环保而受到各国科学家的青睐。

纤维素酶，包含外切-1,4-β-D-葡聚糖酶(exo-β-glucanases,CBH)、内 切-1,4-β-D-葡聚糖酶(endo-β-glucanases,EG)、β-葡萄糖苷酶(endo-β -glucosidases,GE)，可以将纤维素、半纤维素水解为单糖，其中外切-1,4-β -D-葡聚糖酶从纤维素的两端水解结晶纤维素，释放纤维二糖；内切-1,4-β -D-葡聚糖酶作用于纤维素内部的β-1,4糖苷键，随机水解无定形纤维素， 释放各种纤维寡糖；β-葡萄糖苷酶也称纤维二糖酶，主要水解纤维二糖、纤维寡糖，释放葡萄糖。纤维二糖对外切-1,4-β-D-葡聚糖酶和内切-1,4-β -D-葡聚糖酶有抑制作用，而葡萄糖对β-葡萄糖苷酶有抑制作用，当水解 液中的葡萄糖浓度升高时，纤维素的水解效率下降。因此，较低的木质纤 维素酶解效率，较高的纤维素酶使用成本是制约木质纤维素这一可再生能 源开发利用的瓶颈。

直接利用木质纤维素预处理液中的纤维寡糖是有效降低纤维素酶解和 发酵成本，实现木质纤维素高效发酵转化的途径之一。但是纤维寡糖是大 分子物质，不能以自由扩散等简单的扩散方式通过细胞膜，必需转运蛋白 的协助。在目前的工业发酵微生物菌株中，没有纤维寡糖转运蛋白，不具 有直接利用纤维寡糖进行发酵的能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维素发酵工程菌及其构建方法和应用，以 解决上述现有技术存在的问题，通过将火球菌纤维寡糖转运蛋白转入目的 菌株中获得能够高效利用纤维素，尤其是纤维二糖的工程菌，为实现产业 上利用纤维素奠定了基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种纤维素发酵工程菌，所述工程菌中含有火球菌纤维寡 糖蛋白基因；所述的火球菌纤维寡糖转运蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所 示。

本发明提供一种纤维素发酵工程菌的构建方法，所述构建方法包括火 球菌纤维寡糖转运蛋白基因连接到载体上后转入表达宿主感受态细胞，再 诱导转化后表达宿主中火球菌纤维寡糖蛋白表达。

优选的，所述表达宿主感受态细胞的制备方法为氯化钙-氯化镁法。

优选的，所述的氯化钙-氯化镁法的具体步骤包括：

(1)从-40℃取出甘油保藏的E.coli菌种，在超净工作台里用接种环 蘸取菌液，在无抗生素的LA平板上划线，放37℃培养过夜。

(2)从LA平板上挑取生长良好的单菌落，接种到内含5mL LB培养 基的直形瓶，37℃，200rpm培养过夜。

(3)按1％的接种量(v/v)转接到内含100mL LB培养基的锥形瓶 里，37℃，200rpm培养2-3h，菌液OD600至0.4-0.6。

(4)将培养好的菌液使用冰浴进行冷却，冰浴时间约为30min，中间 偶有混匀。