[发明专利]一种纤维素发酵工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种纤维素发酵工程菌，其特征在于，所述工程菌中含有火球菌纤维寡糖蛋白基因；所述火球菌纤维寡糖转运蛋白基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种纤维素发酵工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括火球菌纤维寡糖转运蛋白基因连接到载体上后转入表达宿主感受态细胞，再诱导转化后表达宿主中火球菌纤维寡糖蛋白表达。

3.如权利要求2所述的纤维素发酵工程菌的构建方法，其特征在于，所述表达宿主感受态细胞的制备方法为氯化钙-氯化镁法。

4.如权利要求3所述的纤维素发酵工程菌的构建方法，其特征在于，所述的氯化钙-氯化镁法的具体步骤包括：

(1)从-40℃取出甘油保藏的E.coli菌种，在超净工作台里用接种环蘸取菌液，在无抗生素的LA平板上划线，放37℃培养过夜；

(2)从LA平板上挑取生长良好的单菌落，接种到内含5mL LB培养基的直形瓶，37℃，200rpm培养过夜；

(3)按1％的接种量转接到内含100mL LB培养基的锥形瓶里，37℃，200rpm培养2-3h，菌液OD600至0.4-0.6；

(4)将培养好的菌液使用冰浴进行冷却，冰浴时间约为30min，中间偶有混匀；

(5)在超净台里将充分冷却的菌液分装到预冷的、无菌的容积为50mL的聚丙烯管，在4℃下，5000rpm离心10min，弃去上清；

(6)向聚丙管中加入35mL预冷的氯化钙-氯化镁溶液，轻轻敲打重悬菌体，在4℃下，5000rpm离心5min，弃去上清；

(7)重复步骤6两次；

(8)向聚丙管中加入4mL预冷的甘油-氯化钙溶液，轻轻敲打重悬菌体，在冰上将感受态细胞分装到无菌的、预冷的EP管，每管100μL，放-80℃冷藏。

5.如权利要求2所述的纤维素发酵工程菌的构建方法，其特征在于，所述的火球菌纤维寡糖转运蛋白基因连接到载体上后转入表达宿主感受态细胞的步骤包括：

(1)从-80℃取出大肠杆菌感受态细胞，迅速插入冰里，让大肠杆菌感受态细胞在冰里自然融化；

(2)用微量移液器吸取适量表达载体加入内含100μL大肠杆菌感受态细胞的EP管中，混匀后冰浴静置30min；

(3)将EP管快速地放入42℃水浴，在静置的条件下，热激90s；

(4)热激结束后立即取出EP管，冰浴静置3min；

(5)向EP管内加入200μL SOC培养基，37℃，200rpm培养1h；

(6)取适量体积的培养物涂布到含有相应抗生素的LA平板上，放37℃恒温培养箱倒置培养12-16h。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述诱导转化后目的菌株中火球菌纤维寡糖转运蛋白表达的方法为：

(1)直形瓶中加入5mL含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素的LB培养基，分别从转化平板上挑取生长良好的单菌落到直形瓶中，37℃、200rpm培养10h；

(2)锥形瓶中加入含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素的LB培养基65mL，从步骤(1)所述直形瓶中挑取生长良好的单菌落，按1％的接种量分别转接到内含锥形瓶中，37℃、200rpm培养过夜；

(3)锥形瓶中加入含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素的LB培养基1L，从步骤(2)所述锥形瓶中挑取生长良好的单菌落，按1％的接种量分别转接到步骤(3)所述锥形瓶中，37℃、200rpm培养2-3h，菌液OD600至0.4-0.6时加入终浓度为1mmol/L的IPTG；

(4)重组菌株E.coli Rosetta/pET-Pfu-cbtA放37℃、200rpm培养10-12h进行目的蛋白的诱导表达。

7.一种权利要求1所述的工程菌在纤维素发酵中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的纤维素为纤维寡糖。