[发明专利]猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

说明书

本发明揭示了一种猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用。所述疫苗包含蛋白组合物以及医药学上可接受的载剂，所述蛋白组合物包含分别具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6所示序列的两种融合蛋白。本发明提供的所述疫苗无任何毒性，安全性高，免疫原性好，能够在猪体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，并获得全面保护，且所述疫苗还可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，具有质控容易、批次间稳定、生产成本低等优点。

技术领域

本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，属于动物免疫药物技术领域。

背景技术

猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又称猪喘气病、猪地方流行性肺炎（Swine enzootic pneumoniae，SEP），是由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp）引起的一种接触性和慢性呼吸道传染病，其临床症状表现为咳嗽、气喘、发育迟缓以及料肉比低等。该病主要通过带菌猪和患病猪传染，不同品种、年龄、性别的猪均能感染，其传播途径为直接接触和空气传播，当患病猪和健康猪混合饲养时，常会引发大规模的感染传播。MPS属于免疫抑制性疾病，其感染后往往造成猪支气管纤毛、肺泡巨噬细胞的损伤，降低机体清除外来病原的能力，导致其他病原如猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV）和胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）等的继发感染，引起猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）的发生，这不但增大了猪诊断和防控的难度，也造成了非常严重的经济损失。因此MPS成为当前最常发生、最广流行、最难净化的重要疫病之一，被喻为全球养猪业的“隐形杀手”。

Mhp是一种介于细菌和病毒之间的、最简单且能够自主复制的原核微生物，大小在200nm~400nm之间，没有细胞壁，仅有三层界限膜，呈点状、球状、两级状等多种形态。Mhp主要有以下几种免疫抗原：细胞质蛋白（胞内具乳酸脱氢酶活性的蛋白P36）、膜蛋白（P46、P65和P74）、黏附因子（主要为P97、P101、P216、P159、P116、Mhp107和Mhp271七种蛋白）以及核苷酸还原酶等。P97蛋白是Mhp发现较早且研究非常多的黏附蛋白，是一种重要的毒力因子，它含有R1和R2两个重复区域，在Mhp黏附宿主上皮细胞过程中起到了非常重要的作用。P97蛋白也是Mhp感染猪后最早产生抗体的抗原之一，其中R1区（P97R1）具有很强的免疫原性，在体内能刺激机体产生很强的抗体免疫应答反应，是目前发现的具有开发潜力的抗原区。P36蛋白是一种乳酸脱氢酶，也是Mhp的种特异性蛋白，带有种属特异性的抗原决定簇，主要在Mhp的感染后期发挥作用。研究发现，P36蛋白在自然和人工感染的猪体内均能诱导产生较好的天然免疫应答，是一种免疫优势性蛋白，与其它抗原相比其产生抗体的时间相对较晚，但产生的特异性抗体能维持较长时间。P46蛋白是一种表面脂蛋白，能引起宿主的早期免疫反应，具有高度的种内保守性和较好的特异性和免疫保护力，重组P46蛋白可以诱发机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应，可成为新型Mhp疫苗的候选基因。热休克蛋白（Heatshock proteins，HSPs）是生物细胞在受到理化、生物等因素刺激后，发生热休克反应时所合成的一类最保守的伴侣细胞蛋白。经基因序列分析发现Mhp中的热休克蛋白有DnaK（Mhp072）、DnaJ（Mhp073）、ClpB（Mhp278）、GrpE（Mhp011）以及Lon（Mhp541）等。DnaK蛋白也被称为热休克蛋白70（HSP70），是HSPs家族中最重要的蛋白之一。DnaK蛋白的C-末端主要作用为免疫原和免疫佐剂，可诱导和增强机体的免疫反应；其N-末端则主要表现分子伴侣作用。DnaJ蛋白是刺激DnaK蛋白的ATP酶和蛋白折叠活性的辅助分子伴侣，在整个活体细胞和组织中有活性，纠正或清除细胞内错误折叠并使蛋白失活，指导蛋白质的正确生物活性。信号识别颗粒（Signal Recognition Particle，SRP）途径是一个高度保守的蛋白靶向途径，先后在真核生物、原核生物和古细菌中被发现。原核生物中SRP途径主要由ffh、 FtsY和scRNA组成，其中ffh蛋白具有在各个功能域的协调作用，能够识别结合新生蛋白。