[发明专利]阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒及其制造方法

权利要求书

1.一种阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒，设有试纸卡，所述试纸卡设有PVC板，PVC板上依次设有相搭接的样品垫、结合垫、反应垫、包被膜、吸水垫，其特征在于，其中结合垫上分别吸附有稀土荧光羧基微球标记的亲和素-生物素化的p-Tau217检测抗体复合物及荧光羧基微球-鸡IgY复合物；包被膜上T线包被p-Tau217捕获抗体、C线包被羊抗鸡IgY抗体；所述稀土荧光羧基微球的直径为200nm-350nm，稀土荧光羧基微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在600-630nm的荧光；所述抗体为纯化后的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的p-Tau217抗原表位的单克隆抗体细胞株。

2.一种阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒，其特征在于，所述结合垫的稀土荧光羧基微球的直径范围是200-250nm；所述稀土荧光羧基微球掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土荧光羧基微球掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光羧基微球标记的抗体来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

3.一种如权利要求1或2所述阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒的制造方法，其特征在于，所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于0.1M硼砂-硼酸pH8.8、0.1％Tween80及0.1％酪蛋白、0.05％P300处理液中，4℃浸泡2小时，然后取出37℃烘箱烘干24小时，备用，将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光羧基微球标记的亲和素-生物素化的p-Tau217检测抗体复合物及荧光羧基微球-鸡IgY复合物喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时后制得；

其中结合垫上的稀土荧光羧基微球标记亲和素-生物素-p-Tau217单克隆抗体及荧光羧基微球-鸡IgY采用如下步骤制得：

步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照p-Tau217氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成20个氨基酸左右的多肽序列，交联到KLH上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，将所获得的细胞株对应的单克隆抗体进行配对实验和亲和力测定实验，根据实验结果确定捕获抗体和检测抗体；

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化用于检测的p-Tau217单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤3：稀土荧光羧基微球标记的生物素话的p-Tau217单克隆抗体的制备：将1mg用于链霉亲和素和与稀土荧光羧基微球混合，通过EDC/NHS的作用，4℃反应过夜，将亲和素和羧基微球偶联；然后，加入终浓度为2％Gly，4℃反应4小时封闭；然后用100mM Tris-HCL，pH8.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于1mL的100mM pB7.2缓冲液中，然后加入0.5mg生物素化的p-Tau217抗体，37℃孵育20分钟，然后离心10分钟，弃上清，沉降的微球-亲和素-生物素化的p-Tau217抗体复合物用0.1M Tris-HCL 8.0、4％海藻糖、0.1％Tween20重悬；

步骤4：稀土荧光羧基微球标记的鸡IgY的制备：将1mg鸡IgY和与稀土荧光羧基微球混合，通过EDC/NHS的作用，4℃反应过夜，将鸡IgY和羧基微球偶联；然后，加入终浓度为2％Gly，4℃反应4小时封闭；然后用100mM Tris-HCL，pH8.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，然后离心10分钟，弃上清，沉降的微球-IgY复合物用0.1M Tris-HCL 8.0、4％海藻糖、0.1％Tween20重悬，4℃储存备用。

4.一种如权利要求3所述阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒的制造方法，其特征在于，所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得：

根据配对实验和亲和力测定实验，选择用于捕获的抗体对应的单克隆抗体细胞株，按照标准的腹水生产工艺制备并纯化用于捕获的p-Tau217单克隆抗体，保存于-20℃备用；

分别用包被稀释液将p-Tau217单克隆抗体和羊抗鸡IgY抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干96小时。