[发明专利]一种基于叠氮炔环加成和电化学调控原子转移自由基聚合的卡那霉素电化学检测方法

说明书

一种基于叠氮炔环加成和电化学调控原子转移自由基聚合的卡那霉素电化学检测方法，属于生命科学分析技术领域。其检测原理为：将修饰N₃基团的卡那霉素发卡样适配体固定在金电极表面，卡那霉素出现时会引起适配体构象的改变导致N₃远离电极表面，在Cu⁺催化下与PBIB发生叠氮炔环加成反应，随后大量FMMA通过eATRP连接聚合在展开的发卡适配体末端，最终经方波伏安法测定电流强度与卡那霉素浓度呈正相关，绘制电化学信号与卡那霉素浓度之间的标准曲线得到线性方程，测量待测样品的电化学信号通过计算即可实现卡那霉素的灵敏检测。本发明方法提供了一种对卡那霉素有高选择性，同时又简单、快捷、灵敏的检测方法，具有良好的实用价值，便于推广。

技术领域

一种基于叠氮炔环加成和电化学调控原子转移自由基聚合的卡那霉素电化学检测方法，属于生命科学分析技术领域。

背景技术

卡那霉素是一种提取于链霉菌、小单胞菌培养液或以天然品为原料半合成提取而得到的碱性氨基糖苷类抗生素。卡那霉素溶于水，对革兰氏阴性杆菌具有较强作用，同时价格便宜、可在临床上作为一种重要的抗感染药物。在目前，卡那霉素也是我国农业、畜牧业以及水产业中常用的兽药之一。由于动物源性食品中的卡那霉素可在人体内蓄积，对人体造成一定程度的伤害。例如，卡那霉素会影响耳蜗神经，从而诱发耳毒症，造成听力损伤。此外，卡那霉素对肾脏也有一定损伤，会导致肾功能衰竭，因此，卡那霉素的残留问题也越来越受到关注。为保障人类健康，世界各国对牛奶中卡那霉素残留的最大允许残留量(MRL)作出了规定要求，其中我国规定牛奶中卡那霉素的MRL值为200μg/kg。目前，国内外关于卡那霉素的检测方法主要有：微生物检测法、免疫检测法、理化检测法等。其中，微生物检测法操作简单，经济实用，但专一性差并且只能对有生物活性的物质进行检测，具有一定的局限性。理化检测法主要包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等，方法灵敏度较高，但检测程序复杂且仪器昂贵。因而进一步研究一种灵敏度高、易于操作、选择性高的新方法显得尤为重要。

核酸适配体是通过指数配体富集进化技术(SELEX)筛选得到的对特定物质(小分子化合物、蛋白质、细胞、离子等)具有高度亲和性的一段单链DNA或者RNA。相对于免疫识别检测技术，适配体因具有易合成、化学性质稳定、易于修饰、无免疫原性、价格低廉等优势在生物传感领域得到快速发展。基于适配体建立的生物传感检测体系具有灵敏度高、特异性强等优点，自卡那霉素适配体筛选得到以来，各种卡那霉素的生物传感检测方法不断涌现出来。

与此同时，为了提高检测性能，各种信号放大技术，如杂交链式反应、滚环扩增反应、纳米材料、聚合反应等被应用于生物传感领域。其中，原子转移自由基聚合反应(ATRP)具有反应进程可控、反应单体广泛等优点，自90年代被提出以来在材料、合成等领域得到了大量应用，其在生物传感中的应用也得到科研工作者的青睐。

发明内容

针对现存技术不足，本发明目的是提供一种基于叠氮炔环加成和电化学调控原子转移自由基聚合的卡那霉素电化学检测方法，具有高特异性、高灵敏度等特点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案：

一种基于叠氮炔环加成和电化学调控原子转移自由基聚合的卡那霉素电化学检测方法，包括以下步骤：

(1)发卡DNA的预处理

卡那霉素DNA适配体(发卡适配体序列为：5’-N₃-TTT TTT TGG GGG TTG AGG CTAAGC CGA CTC GGAACC CCC A-(CH₂)₆-SH-3’)粉末溶解在TE溶液中(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH＝7.4)并在95℃加热15min，然后缓慢冷却至室温；

(2)金电极的预处理