[发明专利]特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用

说明书

本发明提供一种特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用。本发明通过将hMRGPRX4表达在大鼠痒觉神经元中，成功构建出一种人源化大鼠，具体方法包括：分别构建转基因大鼠品系hMRGPRX4‑Cre和lsl‑hMRGPRX4‑mScarlet，并将两个转基因大鼠品系进行交配，得到特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠。本发明为研究hMRGPRX4的功能和筛选靶向hMRGPRX4的抗瘙痒药物提供了动物模型。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用。

背景技术

慢性肝病患者常伴有难以忍受的瘙痒，高达60％的原发性胆汁性胆管炎(Primarybiliary cholangitis,PBC)患者有慢性瘙痒的症状，严重影响患者的生活质量。但目前仍然缺乏缓解或治疗该瘙痒的有效药物。最近研究表明，人源MRGPRX4介导胆酸引起的胆汁淤积性瘙痒。胆酸(cholic acid,CA)及其衍生物可以激活hMRGPRX4；患有瘙痒症状的慢性肝病患者血清中胆酸含量显著高于正常人；胆酸以及hMRGPRX4的激动剂可以在健康人皮肤中引起明显的瘙痒。因此，hMRGPRX4是治疗人胆汁淤积性瘙痒的药物靶点，hMRGPRX4的拮抗剂将是治疗这类瘙痒的备选药物。

目前开发治疗瘙痒药物面临的技术瓶颈主要在于，人与模式动物的痒觉感受存在分子机制的差异，使其缺乏有效的动物模型。因此，动物实验中应用有效的药物在转向临床用于人类时往往无效。这种药物疗效的差异导致昂贵的临床前和临床研究失败。因此，特异性靶向人源蛋白/受体开发治疗疾病的药物将是今后药物开发的趋势。此外，对于开发治疗人胆汁淤积性瘙痒的药物，由于MRGPRX4是灵长类特有的受体，在小鼠和大鼠中均没有功能同源的基因²，因此无法通过传统的遗传学方法，比如基因敲除，在模式动物中研究此基因的功能，以及在体筛选备选药物。

因此，亟需建立合适的动物模型用于在体研究hMRGPRX4的功能，筛选和验证hMRGPRX4拮抗剂对瘙痒的抑制作用，鉴定引起瘙痒的胆酸类似物，以及筛选降低瘙痒副作用的胆酸衍生物。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性表达hMRGPRX4(人源MRGPRX4)的转基因大鼠的构建方法及其应用。

本发明的技术原理：人源胆酸受体MRGPRX4可以介导胆汁淤积性瘙痒；大鼠的MrgA受体标记大鼠DRG痒觉神经元；通过MRGPRX4激活大鼠DRG痒觉神经元可以引起瘙痒。本发明利用CRISPR-Cas9基因敲入技术，构建特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠模型。此模型可以用于研究hMRGPRX4介导痒觉感受的功能，筛选并验证hMRGPRX4的拮抗剂，开发用于治疗胆汁淤积性瘙痒的药物。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法，包括：

A、构建CRISPR-Cas9系统介导的大鼠MrgA基因敲除且定点整合外源基因①的转基因大鼠品系I；其中，所述外源基因①是hMRGPRX4基因和重组酶基因之间通过P2A自切割肽段序列(5′-GCCACCAACTTCAGCCTGCTCAAGCAGGCCGGAGATGTGGAAGAGAACCCCGGCCCT-3′)连接而成，且所述CRISPR-Cas9系统靶向MrgA阳性的大鼠DRG神经元细胞；

B、构建CRISPR-Cas9系统介导的大鼠Rosa26基因敲除且定点整合外源基因②的转基因大鼠品系II；其中，所述外源基因②是hMRGPRX4基因和荧光报告基因之间通过iP2A自切割肽段序列(5′-GCGACGAATTTTAGTCTACTGAAACAAGCGGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT-3′)连接而成，所述外源基因②由CAG启动子驱动，且在所述CAG或CMV启动子(也可以使用其它强启动子)启动子与外源基因之间包含一段受步骤A中所述重组酶条件性控制的STOP序列；其中，CAG启动子的序列如SEQ ID NO:4所示。