[发明专利]特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用

权利要求书

1.特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法，其特征在于，包括：

A、构建CRISPR-Cas9系统介导的大鼠MrgA基因敲除且定点整合外源基因①的转基因大鼠品系I；其中，所述外源基因①是hMRGPRX4基因和重组酶Cre基因之间通过P2A自切割肽段序列连接而成，且所述CRISPR-Cas9系统靶向MrgA阳性的大鼠DRG神经元细胞，且CRISPR-Cas9系统靶向位点位于MrgA基因内含子1和外显子2处；

B、构建CRISPR-Cas9系统介导的大鼠Rosa26基因敲除且定点整合外源基因②的转基因大鼠品系II；其中，所述外源基因②是hMRGPRX4基因和荧光报告基因之间通过iP2A自切割肽段序列连接而成，所述外源基因②由CAG或CMV启动子驱动，且在所述CAG启动子与外源基因之间包含一段受步骤A中所述重组酶条件性控制的STOP序列；

C、将品系I与品系II大鼠进行交配，得到特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠；

其中，所述hMRGPRX4基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述STOP序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中gRNA作用位点的DNA序列为5′-TCCGGTTAGGAGTAAATTCC-3′和5′-TGAGACAGCGGAAAACACGG-3′；和/或

步骤B中gRNA作用位点的DNA序列为5′-GACTCCAGTTGCAGATCACG-3′。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述荧光报告基因编码红色荧光蛋白mScarlet。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括：根据大鼠MrgA基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到gRNA和Cas9 mRNA，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因①的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的Cas9 mRNA、gRNA和供体质粒共同转入野生型大鼠的受精卵中，然后将克隆胚胎通过非手术法移入大鼠子宫内进行妊娠，获得转基因大鼠。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B包括：根据大鼠Rosa26基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到gRNA和Cas9 mRNA，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因②的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的Cas9 mRNA、gRNA和供体质粒共同转入野生型大鼠受精卵中，然后将克隆胚胎通过非手术法移入大鼠子宫内进行妊娠，获得转基因大鼠。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A和B中所述hMRGPRX4基因的3’端带有3×Flag标签序列。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述大鼠为SD大鼠。

8.根据权利要求1-7任一项所述方法构建的转基因大鼠的以下任一应用：

(1)用作筛选治疗或缓解人胆汁淤积性瘙痒症药物的动物模型；

(2)用于筛选治疗或缓解人胆汁淤积性瘙痒症的药物；

(3)用于检测引起人胆汁淤积性瘙痒症的物质；

(4)用于筛选hMRGPRX4受体的激动剂或抑制剂；

(5)用于hMRGPRX4基因功能的研究。

9.提高hMRGPRX4基因在大鼠MrgA阳性神经元表达量的方法，其特征在于，包括：将转基因大鼠品系I与转基因大鼠品系II进行交配；

其中，所述转基因大鼠品系I、转基因大鼠品系II同权利要求1-7中任一项所述。