[发明专利]一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法及其检测方法

权利要求书

1.一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：制备羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点：

a.制备InP量子点溶液：在氮气气氛下，将InCl₃加入十二烷胺溶剂中，加热至180～200℃，通入PH₃，反应0.5h后，冷却至常温，丙酮清洗3次，70℃真空干燥6h，得到InP量子点固体粉末，并加入正己烷和乙醇的等体积比混合液中，超声分散10min，得到InP量子点溶液；InCl₃、PH₃、十二烷胺、正己烷和乙醇的等体积比混合液的用量比为5mmol：(12～18)mmol：45mL：10mL；

b.配制巯基乙酸修饰镉盐前体溶液：将CdCl₂、巯基乙酸溶解于去离子水中，控制Cd²⁺、巯基乙酸、去离子水的用量比为3mmol：8～10mmol：10mL，得硫源修饰镉盐前体溶液；

c.制备羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液：将巯基乙酸修饰镉盐前体溶液分五次加入InP量子点溶液中，期间不断搅拌，再加入氧化石墨烯，控制前体溶液、InP量子点溶液、氧化石墨烯的用量比为10mL：10mL：(0.1～0.15)g，并超声分散0.5h，用NaOH调节pH值为10，在紫外灯辐射下，搅拌反应1～3h，再加入一氯乙酸调节pH值为6.0，继续搅拌反应1～3h，制得羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液；

步骤二：制备样品垫：配制0.05M Tris-HCL缓冲液并调节pH为8.2，加入1％的表面活性剂吐温20及0.2％酪蛋白钠，充分混匀溶解后将玻璃纤维素膜浸泡其中，待完全浸泡充分后于37℃烘干，得到样品垫；

步骤三：制备标记垫：

a.活化量子点溶液：取100uL羧基修饰石墨烯/InP/CdS量子点溶液分散于900uL的10mM、pH＝6.0MES缓冲液中，加入100uL的10mM偶联剂EDC，搅拌均匀后，37℃反应15min，以15000r/min转速离心20min，弃上清，用1.0mL的10mMpH＝6.0MES缓冲液重悬，超声辅助混匀，得到活化量子点溶液；

b.制备复合抗体量子点标记液：分别量取三组300μL活化量子点溶液，各加入10μg胃蛋白酶原I标记抗体或胃蛋白酶原II标记抗体或鸡IgY抗体中的一种，迅速混匀，37℃反应2h，再加入50μL封闭剂溶液，搅拌均匀，37℃反应1h，以15000r/min转速离心40min，弃上清，即得胃蛋白酶原I抗体/胃蛋白酶原II抗体/鸡IgY抗体标记复合物沉淀；并将所得三种标记沉淀混合均匀，再用处理液复溶至80μl，超声辅助混匀，得到复合抗体量子点标记液；

所述处理液配方为：pH＝7.2、0.02M PB缓冲液+1％(w/v)BSA+5％(w/v)海藻糖；

c.制备标记垫：将标记液直接喷涂于玻璃纤维素膜上，喷膜浓度为2.5μl/cm，于37℃烘干，得到标记垫；

步骤四：制备抗体包被的划线NC膜：以硝酸纤维素膜作为NC膜，在NC膜上依次等间隔划分出检测线T2、T1及质控线C，并用1.0mg/mL胃蛋白酶原I抗体涂覆包被T1线，1.0mg/mL胃蛋白酶原II抗体涂覆包被T2线，0.5mg/mL鸡IgY抗体涂覆包被C线，涂覆用量均为1μL/cm，于37℃烘干后，即得抗体包被的划线NC膜；

步骤五：组装检测试纸：将样品垫、标记垫、抗体包被的划线NC膜、吸收垫依次粘附在底板上，且NC膜上的T2线与标记垫相邻，并切条制成检测试纸。

2.根据权利要求1所述一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法，其特征在于，所述紫外灯辐射功率为60～100W。

3.根据权利要求1所述一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法，其特征在于，所述封闭剂溶液配方为：150mM甘氨酸+5％(w/v)BSA。

4.根据权利要求1所述一种胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II联合定量检测试纸的制备方法，其特征在于，所述检测试纸宽度为3.2～4.6mm，长度为5.0～7.0cm。