[发明专利]检测H5N1甲型流感病毒血凝素的方法

说明书

本发明公开了检测H5N1甲型流感病毒血凝素的方法,步骤:对稀土掺杂上转换发光纳米颗粒进行水溶性修饰；完成H5N1 HA核酸适配体在纳米颗粒表面的偶联，得到上转换荧光探针；作出标准曲线；制备待测样品的检测体系，测定待测样品的相对荧光强度；根据标准曲线得到待测样品中H5N1 HA的浓度；本发明的检测方法是快速、简便、性能稳定，识别原件核酸适配体通过特异性识别作用改变自身空间结构，实现检测体系荧光信号的恢复。荧光受体氧化石墨烯荧光吸收范围广，能够实现绿色上转换荧光信号猝灭。该检测体系能够较大程度降低背景信号，提高检测灵敏度。该均相免洗的检测体系能够实现H5N1甲型流感病毒的高效检测。

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种检测H5N1甲型流感病毒血凝素的方法。

背景技术

甲型流感病毒是引起季节性流感的重要病原体，其频繁暴发给全球公共卫生带来巨大挑战。流感病毒通常会获得新的抗原性，即抗原转移，这导致出现了新的病毒株，在人群中普遍缺乏相应的的免疫力，从而导致流感大流行；其中，流感病毒的的血凝素HA与宿主表面特异性唾液酸糖受体结合，在病毒的致病力方面起关键作用，因此HA适合作为检测的目标物。流感病毒感染的快速、准确诊断对于有效控制疫情，降低发病率和病死率至关重要。

为了实现对病毒病的有效预防和控制，亟需开发相应的高灵敏、快速的甲型流感病毒检测技术。目前国内外检测确诊的方法可以分为病原学、血清学、分子生物学诊断技术。流感病毒的分离培养是传统的病原学诊断技术，该技术被认为是鉴别流感病毒最经典、最严谨的方法，该过程通常需要2～14天，缺点是操作步骤繁琐、周期较长以及生物安全性较低。血清学检测方法在患者发病初期抗体滴度低，经两周后抗体滴度才能有明显提高，该方法只能适用于流行病学调查和研究，不能作为早期诊断的方法。酶联免疫吸附实验是使用酶标识的抗原或者抗体，经显色反应检测抗体或抗原的检测技术，检测结果易于分析，安全高效，成本低廉，但可能会出现假阳性结果，不能区分出其血清亚型。随着科学技术的发展，基于等温扩增技术的分子生物学方法能够应用于流感病毒的现场快速检测和筛查中，但是，这些等温扩增技术均需要酶的参与，存在试剂价格昂贵、反应体系复杂、试剂保存条件严格等问题。

因此急需发展一种快速、简便、反应体系简单的适用于H5N1甲型流感病毒的快速检测和诊断的检测方法。

发明内容

本发明的目的克服现有技术的不足，提供一种检测H5N1甲型流感病毒血凝素的方法。

本发明的技术方案概述如下：

检测H5N1甲型流感病毒血凝素的方法，包括以下步骤：

(1)采用表面配体交换法，使用聚丙烯酸对稀土掺杂上转换发光纳米颗粒进行水溶性修饰；

(2)采用缩合反应，完成H5N1 HA核酸适配体在步骤(1)获得的纳米颗粒表面的偶联，得到上转换荧光探针；

(3)取100～200μg上转换荧光探针分散在100～200μl、pH＝7.8的硼酸盐缓冲液中；分别加入已知的不同终浓度的H5N1 HA标准品，在20～40℃孵育20～60分钟，分别加入终浓度为50～300μg/ml的氧化石墨烯，20～40℃孵育20分钟，用pH＝7.8的硼酸盐缓冲液定容至300μl，分别测定980nm激发波长时542nm发射波长的荧光值F，同时测定空白荧光值F₀，作出相对荧光强度[(F-F₀)/F₀]与H5N1 HA浓度对应的标准曲线；

(4)制备待测样品的检测体系，测定待测样品的相对荧光强度；根据所述标准曲线得到待测样品中H5N1 HA的浓度；

H5N1 HA为H5N1甲型流感病毒血凝素的缩写。

稀土掺杂上转换发光纳米颗粒的颗径为17～20nm。