[发明专利]一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用有效
申请号: | 202011102574.1 | 申请日: | 2020-10-15 |
公开(公告)号: | CN112251413B | 公开(公告)日: | 2021-05-14 |
发明(设计)人: | 焦顺昌;张嵘;袁翰;张艳玲;李斯慧;冯向辉;宋文静;吕鹏敏;钟宏东;胡坤 | 申请(专利权)人: | 焦顺昌;北京鼎成肽源生物技术有限公司 |
主分类号: | C12N5/10 | 分类号: | C12N5/10;C12N15/85;C12N15/50;A61K39/215;A61P31/14 |
代理公司: | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人: | 吕纪涛 |
地址: | 102200 北京市昌平区双*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 表达 新型 冠状病毒 抗原 细胞 制备 方法 应用 | ||
本发明提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用,属于基因工程技术领域。所述方法包括:将序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到PB‑713质粒中,得到PB‑S‑RBD‑NGFR质粒;将PB‑S‑RBD‑NGFR质粒电转化到K562细胞中,经嘌呤霉素筛选,当活细胞比例持续大于80%时,得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。本发明将新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域单独进行跨膜的细胞表达,避免了其它S蛋白表位导致的抗体依赖性增强的风险,再将新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域与跨膜蛋白结构域融合后,在动物体内诱发出更佳的中和滴度。
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,尤其涉及一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV,SARS-CoV-2)是一种β属的冠状病毒,感染该病毒后可导致患者出现发热、干咳、乏力等症状;部分患者会产生严重的肺炎,进而发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等,甚至死亡。SARS-CoV-2病毒通过其表面的囊膜蛋白吸附和进入宿主细胞,从而感染人的呼吸道上皮细胞及肺泡细胞。SARS-CoV-2的囊膜蛋白即刺突蛋白(Spike protein,S)是一种糖蛋白,主要作用于细胞粘附和细胞膜融合。
S蛋白由S1和S2两个亚基组成,其中S1亚基中包含受体结合结构域(ReceptorBinding Domain,RBD)介导吸附作用,S2亚基主要体现融合活性。RBD与细胞表面血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合,是病毒和受体相互作用以及病毒入侵细胞的关键因素。RBD是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。由于目前没有效果非常好的药物、治疗性抗体、疫苗等用于SARS-CoV-2病毒感染的治疗和预防,因此开发针对SARS-CoV-2病毒的疫苗对于健康人的保护及应对病毒的再次爆发是至关重要的。然而,将病毒的全长蛋白作为临床使用的抗原可以引起部分的对于病毒的预防作用,但也常见到临床报道有抗体依赖性增强(Antibody-dependent enhancement,简称ADE)作用,从而产生比未用疫苗者更加严重的病毒感染。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用,本发明将新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域单独进行跨膜的细胞表达,避免了其它S蛋白表位导致的抗体依赖性增强的风险,再将新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域与跨膜蛋白结构域融合后,在动物体内诱发出更佳的中和滴度。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法,包括以下步骤:
1)将序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到PB-713质粒中,得到PB-S-RBD-NGFR质粒;所述序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;
2)将所述步骤1)得到的PB-S-RBD-NGFR质粒电转化到K562细胞中,经嘌呤霉素筛选,当活细胞比例持续大于80%时,得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。
优选的,所述步骤2)嘌呤霉素筛选时的使用浓度为5μg/ml。
优选的,所述步骤2)电转化的条件包括:560V、30ms。
优选的,所述步骤2)PB-S-RBD-NGFR质粒的质量与K562细胞的数量比为10μg:1×107cells。
优选的,所述步骤2)筛选的时间在7d以上。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的制备方法制备得到的跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞,所述细胞的细胞膜上表达信号肽、新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域和跨膜蛋白结构域;
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