[发明专利]毕赤酵母定点DSB系统及应用

说明书

本发明涉及一种毕赤酵母定点DSB系统，构建步骤如下：构建site‑I‑SceI‑KanMX转化盒，利用诱导型启动子，电转化野生毕赤酵母GS115菌株，即得毕赤酵母定点DSB系统。本发明以毕赤酵母为载体，利用归位内切酶I‑SceI建立的定点DSB诱导系统，可以提高转化效率，同时细胞对其修复应答产生了Aneuploidy，与人肿瘤细胞中的Aneuploidy相似，可以作为一个研究定点DSB导致的Aneuploidy模型。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种毕赤酵母定点DSB系统及应用，通过诱导毕赤酵母定点DSB，研究酵母细胞的修复应答。

背景技术

毕赤酵母作为应用最广泛的外源蛋白真核表达系统之一，如何提高重组效率显得尤为重要。基于毕赤酵母较低的同源重组效率，有学者通过敲除非同源末端(NHEJ)相关基因Ku70/80阻断NHEJ通路，增加同源重组(HR)通路，提高同源重组效率，或者利用CRISPR/Cas9系统在毕赤酵母中进行精确的基因编辑工程。但是，阻断NHEJ通路会影响毕赤酵母自身的代谢反应，而CRISPR/Cas9系统不适合于外源基因的整合。

目前对毕赤酵母的DNA损伤机制知之甚少，毕赤酵母细胞中NHEJ是DNA损伤的主要修复通路，其同源重组能力较弱，这与哺乳动物细胞相似。同时，毕赤酵母被用于高密度发酵，对活性氧(ROS)等有很强耐受性，该特性与肿瘤细胞相似。诱导毕赤酵母细胞定点发生DSB，研究其修复应答机制，可作为继酿酒酵母之后研究细胞DNA损伤修复机制的又一模式菌株。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种毕赤酵母定点DSB系统及应用，通过诱导毕赤酵母定点DSB，研究酵母细胞的修复应答。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种毕赤酵母定点DSB系统，构建步骤如下：

构建site-I-SceI-KanMX转化盒，利用诱导型启动子，电转化野生毕赤酵母GS115菌株，即得毕赤酵母定点DSB系统。

而且，构建site-I-SceI-KanMX转化盒时，I-SceI酶识别位点Site序列为：SEQ IDNO.1：TAGGGATAACAGGGTAAT。

而且，所述诱导型启动子为醇氧化酶AOX基因启动子、半乳糖GAL启动子或四环素TetR启动子。

而且，当诱导I-SceI酶表达时，识别特异性位点进行酶切反应，发生定点DSB，此时，细胞发生修复应答，DNA重组修复效率提高，从而使外源基因整合效率提高，同时，细胞在对损伤修复应答时发生了染色体异倍性现象，并稳定存在且可遗传。

如上所述的毕赤酵母定点DSB系统在作为研究定点DSB导致细胞DNA损伤的模型方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明使用归位内切酶I-SceI，定点识别切断酶切位点，造成DSB的发生，建立定点DSB诱导系统，可以很好地提高转化效率，构建了高效转化的模式菌株。

2、本发明以毕赤酵母为载体，利用归位内切酶I-SceI产生的定点DSB模式菌株，细胞可对其修复应答产生Aneuploidy，与肿瘤细胞中的Aneuploidy相似(见图2)，可以作为一个研究定点DSB导致的Aneuploidy模型。

3、本发明产生的定点DSB模式菌株,可产生Aneuploidy现象，有利于毕赤酵母细胞的生长，且会产生一定的耐药性；且毕赤酵母本身可以进行高密度发酵，具有耐受ROS的特性，与肿瘤细胞特征相似。且DSB模式菌株基因组未发生大的改变，与细胞NHEJ修复通路及端粒酶表达缺乏相关性，可以作为一个很好的研究定点DSB导致细胞DNA损伤的模型。