[发明专利]一种免培养快速检测酱油产气菌的方法

说明书

本发明公开了一种免培养快速检测酱油产气菌的方法，包括以下步骤：S1、采集胀气酱油的样品；S2、对胀气酱油的样品进行高通量测序分析，测定胀气样品的微生物组成；S3、对胀气样本和正常酱油样品进行PCA分析，找出胀气样品的产气关键菌；S4、根据产气关键菌的16S基因序列，设计专一性引物；S5、采用染色剂‑荧光定量PCR对待检测样品进行鉴定，确定待检测样品的Ct值；S6、Ct值超过m，待测样品判为合格，Ct值低于m，待测样品判为不合格。本发明采用高通量测序和染色剂‑荧光定量PCR相结合的方法，能够快速检测酱油产气菌，对酱油样品进行测定，实现酱油质量的快速判别。

技术领域

本发明涉及酱油质量检测领域，具体涉及一种免培养快速检测酱油产气菌的方法。

背景技术

酱油是中国家庭常用的调味品，其味道鲜美、酱香浓郁、色泽红亮，深受消费者喜爱。酱油酿造及后处理过程繁复，会接触很多管道和包材，导致微生物感染的可能，造成酱油成品在货架期出现胀瓶，影响酱油品质甚至可能对消费者人身安全造成损伤。如何在出厂之前快速的将酱油成品中的微量微生物进行检测，排除可能导致的安全风险因素，这是酱油生产企业亟需解决的问题。

酱油工厂通常采用基于微生物培养的方法来进行检测，但是由于酱油胀气菌通常难以培养，并且胀气菌在出厂检验时含量太低，通过传统的微生物培养的方法难以有效甄别，而且由于酱油产地的不同，生产工艺的差异性，不同工厂酱油产气关键菌也是不一样的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种免培养快速检测酱油产气菌的方法，基于高通量测序靶向确定酱油产气关键菌，并通过染色剂-荧光定量PCR的方法，快速检测待测样品产气活菌含量，保障酱油在货架期的安全。

本发明通过下述技术方案实现：

本发明提供一种免培养快速检测酱油产气菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、采集胀气酱油的样品；

S2、对胀气酱油的样品进行高通量测序分析，测定胀气样品的微生物组成；

S3、对胀气样本和正常酱油样品进行PCA分析，找出胀气样品的产气关键菌；

S4、根据产气关键菌的16S基因序列，设计专一性引物；

S5、采用染色剂-荧光定量PCR对待检测样品进行鉴定，确定待检测样品的Ct值；

S6、Ct值超过m，待测样品判为合格，Ct值低于m，待测样品判为不合格。

本发明采用高通量测序和染色剂-荧光定量PCR相结合的方法，能够快速检测酱油产气菌，对酱油样品进行测定，实现酱油质量的快速判别。传统微生物培养检测方法需要2～5天的时间，而且对于难培养的菌株来说传统培育方法难以成功，而本发明的检测方法能够在2小时以内对样品进行检测且精度更高，结果更为准确。本发明基于免培养技术开展检测，有效规避了传统培养的缺陷。

其中，染色剂-荧光定量PCR加入的染料能够与酱油中死亡细胞DNA接合，阻止死亡细胞DNA与DNA聚合酶接合，避免出现死亡细胞的扩增，染料无法进入活细胞，因而染色剂-荧光定量PCR扩增出来的片段表征的是活细胞的数量，大大提高了检测的精确度。

步骤S6中，m值的计算方式如下：向无菌酱油中分别加入不同体积份数的胀气酱油，对接种后的混合酱油进行染色剂-荧光定量PCR，获得各样品的Ct值，而后将样品放置30～37℃培养6～12个月，出现胀气的样品中接种胀气酱油量最低的样品Ct值记为m。

步骤S4中所述专一性引物是指根据高通量测序出来产气关键菌的16S序列，设计该产气关键菌的特征性引物。

步骤S5中，DNA染料采用EMA、PMA或PMAxx。

步骤S5中，DNA染料加入的终浓度为10～50μg/mL。