[发明专利]一种新型CRISPR核酸检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种新型CRISPR核酸检测方法及应用，检测方法，包括如下步骤：步骤一，样本处理；步骤二，制备反应体系；反应体系包括：与待检测靶标序列互补的crRNA，tracrRNA，Cas14酶，酶缓冲液；步骤三，将待检测核酸和探针加入核糖蛋白复合体溶液中；步骤四，酶切反应，信号的检测和结果的判读；本发明可以应用于检测单链DNA、RNA、双链DNA、单位点突变的CRISPR核酸等多种核酸和多个位点，设计灵活性高，特异性好，方便快捷，成本低廉。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是一种新型CRISPR核酸检测方法及应用。

背景技术

近年来，CRISPR核酸检测技术日新月异，在病原体检测，遗传病检测，癌症检测，微生物耐药性检测，环境微生物检测等领域的应用增长迅速。

最早的CRISPR核酸检测技术是利用氨基酸修饰的dCas9蛋白与EGFP荧光蛋白融合，在特定的向导RNA引导下，特异性与靶标序列结合。该方法耗时长，成本高，操作复杂，实际应用比较困难。

CRISPR核酸检测技术的转折点在2016年，张峰团队发现Cas13a具有旁路切割活性。当Cas13a与带有靶标识别区域的crRNA结合后，能够特异性识别靶标单链RNA，并对靶标RNA进行切割。于此同时，该酶的旁路切割活性被激活，非特异性地剪切附近的单链RNA。利用这一技术，2017年，第一种较为简单且实用的CRISPR核酸检测技术SHERLOCK诞生。同一时期，Cas12a的旁路切割活性亦被发现。不同于Cas13a，Cas12a在向导RNA的引导下，能够特异性识别和结合双链DNA，并获得对单链DNA的旁路切割活性。在此技术的基础上，DETECTR和HOLMES检测法相继发表。

这些方法目前已被应用于病原体检测，单位点多态性检测等多个领域，相比于传统的Realtime-PCR或FISH杂交技术，具有速度快，特异性高，操作简单等特点。

目前应用于CRISPR核酸检测的Cas酶主要有Type II型的dCas9,type V型的Cas12a、Cas12b，Cas12c和type VI型的Cas13a，Cas13b等。dCas9因为不具有旁路切割活性因而无法起到信号放大的作用，其检测的灵敏度不高，且操作复杂。基于Cas13的SHERLOCK核酸检测方法，特异性的识别RNA片段，与常用的片段扩增技术的兼容性差，需要在反应中引入T7反转录步骤，使其难度和可操作性都较高。基于Cas12的DETECTR和HOLMES,其检测的底物可以是双链DNA也可以是单链DNA，但是在已单链DNA为检测物的时候，其特异性存在一定的下降，对位点突变等不敏感。

此外现有的CRISPR检测方法，在设计靶标序列的时候，都需要考虑PAM(protospacer adjacent motif)位点这一前提。比如Cas12的靶标序列必须设计在一段TTTN或TTN的PAM位点下游附近，否则该方法无法有效识别靶标序列。特定的PAM位点序列在某些生物中出现的概率并不高，这给整个检测的设计带来了困难。

与此同时，Cas9，Cas12和Cas13的分子量都较大，且存在较长的疏水区域，在表达上存在一定的难度，提高了物料成本。

根据市场上产品的这些缺陷，开发一种在靶标设计上不受PAM位点限制，且能够检测包括单链DNA,双链DNA，RNA在内的核酸，成本低廉，操作简便，特异性好的CRISPR方法，在科学研究和产业应用上都具有重大的意义；本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型CRISPR核酸检测方法及应用，本发明将与待检测靶标序列互补的crRNA、tracrRNA和Cas14酶混合得到核糖核蛋白复合体，直接检测单链DNA、RNA、双链DNA等多种核酸和多个位点，设计灵活性高，特异性好，方便快捷，成本低廉。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：