[发明专利]靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统、重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用

说明书

本申请提供了靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统、重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用，属于生物医学及生物工程领域。本申请提供的靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统，作为一种黏膜免疫投递工具，可用于表达多种来源不同的疫苗抗原，制备重组乳酸菌疫苗，提高口服类疫苗在胃肠道的免疫效果；用靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统制备的重组乳酸菌疫苗LL‑plSAM‑FAdE，可分泌表达含有核心组件SAM和黏附因子多表位肽FAdE的重组抗原SAM‑FAdE，将重组抗原SAM‑FAdE展示在乳酸菌表面，而且将其靶向投递给胃肠道M细胞，实现精准免疫，提高免疫效率，诱导胃肠道产生针对幽门螺旋杆菌的特异性黏膜免疫应答，起到防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的目的。

技术领域

本申请涉及生物医学及生物工程领域，具体而言，涉及靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统、重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用。

背景技术

胃肠道黏膜是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线。口服类疫苗可刺激胃肠道黏膜下丰富的淋巴组织，诱导黏膜免疫反应和全身免疫反应，直接切断病原微生物入侵机体的途径，非常具有吸引力。然而，口服类疫苗的免疫原性一般较弱，需使用大量抗原多次接种，且免疫应答持续时间较短，容易产生免疫耐受。研制口服类疫苗成功的关键在于“设计一种有效的黏膜投递策略，长期稳定地将抗原投递给黏膜免疫诱导位点，激发高水平免疫应答”。微皱褶细胞（M细胞）是胃肠道黏膜免疫系统中一种特化的抗原转运细胞，散布于黏膜上皮细胞间，能将抗原从胃肠腔内转运到上皮下的淋巴组织，诱导黏膜免疫反应。M细胞是胃肠道黏膜免疫系统的“入口”，其对抗原的摄取是启动胃肠黏膜免疫应答关键的第一步。因此，“抗原能否被M细胞大量摄取”是口服类疫苗免疫成败的关键所在。利用“与M细胞表面受体相结合的M细胞靶向肽”，将抗原靶向递呈给M细胞，增加其对抗原的摄取和转运效率，激发高水平黏膜免疫应答，是一种提高口服类疫苗免疫效果的有效策略。

直接口服疫苗抗原，免疫效果往往甚微，其中主要原因是：胃肠道中的大量酸液，会破坏疫苗抗原。黏膜免疫投递系统可避免胃酸对抗原的降解，且具有良好的黏膜佐剂效应，可协助口服类疫苗诱导长期稳定的黏膜免疫应答，是口服类疫苗研究的一个热点。乳酸菌是在人体肠道内一群常见的益生菌，属于食品级微生物，具有无内毒素、安全性好、遗传背景清楚等优点。利用细菌表面展示技术将抗原展示在乳酸菌表面，更符合黏膜疫苗的免疫要求；因此，乳酸菌表面展示系统是黏膜投递系统研究的一个焦点。锚定蛋白是细菌表面展示技术中的核心组件。N-乙酰胞壁质酶（AcmA）是在乳酸菌表面展示系统中常用的一种锚定蛋白。然而，在胞内表达的AcmA往往跨膜转运活性不强。基于AcmA设计更为有效的乳酸菌细胞表面展示系统，仍是一项亟待研究的工作。重组乳酸菌表面展示系统主要是将乳酸菌作为一种工程菌，分泌表达含有锚定蛋白的疫苗抗原；疫苗抗原通过与其偶联的锚定蛋白，展示在乳酸菌表面，所制备的疫苗称为重组乳酸菌疫苗。

幽门螺旋杆菌（Hp）是胃炎、胃溃疡和胃癌的重要致病因子，世界感染率超过50%，我国Hp感染率高达58.07%，且呈现明显的家庭聚集性，形式更加严峻。目前，临床治疗Hp感染性胃病的方法主要是多联抗生素疗法，但是面临着抗生物导致Hp耐药性、治疗后再感染、抗生素破坏肠道微生态平衡、药物毒副作用和病人依从性差等问题，难以在Hp感染人群中大规模推广使用，研发有效的Hp疫苗具有很好的应用前景。Hp对人类胃部的感染，关键的第一步是通过黏附因子黏附胃黏膜细胞。

发明内容

本申请的第一方面，公开了靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统。靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统是一个自主设计的含有核心组件SAM的乳酸菌质粒plSAM；核心组件SAM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；核心组件SAM^E的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

核心组件SAM主要是通过生物信息学对筛选的M细胞靶向杂合肽Mtp、锚定蛋白AcmA的C末端肽聚糖结合区cA、多克隆位点MCS、信号肽SPusp45和前导肽Ps等元件的连接顺序加以分析设计而成。