[发明专利]一种检测脱靶效应方法及其应用

说明书

本申请公开了一种检测脱靶效应方法及其应用。所述方法涉及一套可以检测CRISPR‑Cas脱靶效应的建库流程，内容包括转染试剂的更换，ODN序列的优化，Adaptors的改进，Primers的改善和PCR方法的简化，以及所述方法在CRISPR/Cas基因编辑系统中的应用。一种检测CRISPR/Cas系统脱靶效应的方法，可以实现低门槛，高通量，适合更多普通实验室使用，其测序仪器不再限制于Miseq，可以是通量更大的Hiseq或Novaseq平台。CRISPR/Cas基因编辑系统脱靶效应检测方法可以实现各种CRISPR核酸酶(包括高保真等)的特异性检测。

技术领域

本申请涉及生物医学技术领域，具体涉及一种检测脱靶效应方法及其应用。

背景技术

CRISPR-Cas基因编辑工具是当前应用最热、最广的技术，在临床上具有无限的应用潜能。但其“脱靶”效应的存在，并由此可能引发的安全性问题，严重阻碍了该技术在临床上的进一步应用。为了评估CRISPR-Cas系统基因编辑时在全基因组水平的“脱靶效应”，目前已有多种方法被开发，大概可以概括为以下几类：第一类，如BLESS/DSBCapture/BLISS/End-seq等；第二类，如Digenome-seq/SITE-seq/CIRCLE-seq/CHANGE-seq等；第三类，如Chip-seq/DISCOVER-Seq等；第四类，如WGS/GOTI-seq等；第五类，如IDLV Capture/GUIDE-seq/iGUIDE/TTISS等。这些方法各有优缺点，第一类可以直接反映细胞收集时的双链DNA断裂(DSB)情况，即可能的脱靶位点。但该类方法一般操作较复杂，耗时，需要对细胞进行固定，多次离心(易引入人为DSB)等步骤来最终完成样品制作；第二类为纯体外的DSB检测，将基因组DNA提取后进行核酸酶的消化，然后进行可能的脱靶分析，此方法容易得到假阳性结果，因为忽略基因组的空间结构及表观遗传学因素影响；第三类是通过捕捉DSB修复关键蛋白如γH2AX、MRE11等来间接反映DSB，它要求蛋白抗体有很高的特异性，容易丢失一些假阴性结果；第四类则通过全基因测序检测indel情况来反应脱靶，但其灵敏度较低。最后一类为通过转入外源性物质，如DNA等，来追踪检测其在基因组发生DSB时可能整合入基因组的位置，从而间接反映可能的脱靶位点。该方法操作相对简单，易于实施，灵敏度也较高。其中典型的代表便是GUIDE-seq，它还允许在活体细胞一段时间内监测细胞的DSB断裂累计情况。

目前，GUIDE-seq技术已被广泛应用于各类植物、动物及人细胞中进行CRISPR-Cas脱靶分析。虽然GUIDE-seq普适性较高，但它对实验平台和仪器具有较高的要求，需要具备LONZA核转染仪(4D)及超声波降解仪等，更重要的还需Illumina的Miseq平台及包一整条通道(lane)来测序以产生GUIDE-seq分析所需的Index1，Index2文件。而对于一些小型实验室或课题组，常因为缺少仪器或是测序平台等因素限制了GUIDE-seq技术的普及。

发明内容

本申请的第一个目的是提供一种新的，高通量，低门槛，经济实用、可商业化的无偏检测脱靶效应的方法。

为了达到上述目的，本申请所采用的技术方案为，一种检测脱靶效应方法，所述方法包括如下步骤：

1)对GUIDE-seq的ODN序列进行Tag更改；

2)对GUIDE-seq的转染试剂进行更改；

3)对Adaptors进行更改；

4)对基因组的打断进行更改；

5)对Tag标签序列的PCR引物进行更改；

6)将PCR样品进行多合一PCR。

本申请提供的另一种实施方式为：所述步骤1)中对GUIDE-seq的ODN序列更改Tag后使得GC含量为45.7％。