[发明专利]一种检测脱靶效应方法及其应用

权利要求书

1.一种检测脱靶效应方法，其特征在于，所述方法包括细胞转染，对所述转染细胞基因组DNA进行提取，采用所述提取的DNA构建Tag-seq文库，分析所述Tag-seq文库的生物信息找出潜在脱靶位点；

①细胞转染：

a.转染前一天，用胰酶消化生长状态良好的对数期HEK293T/MCF7细胞，并接种于孔板中，待细胞贴壁密度达到70％～80％时进行阳离子聚合物聚乙烯亚胺PEI转染操作，体系如下：

其中，Tag的核苷酸序列为：

Tag-F：P-A*T*CTCTGAGCCTTATGCGAAATGCGTGTTATCG*C*A；

Tag-R：P-T*G*CGATAACACGCATTTCGCATAAGGCTCAGAG*A*T

其中，P表示磷酸化修饰；*表示硫代磷酸酯键修饰；

将A液与B液混匀，室温静置10分钟后，加到细胞培养上清中；

b.隔天进行细胞换液之后72小时，收集细胞并应用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA后，溶于TE buffer并用核酸仪进行浓度测定；

②取基因组DNA 800ng：

a.进行Fragmentation,End PreparationdA-tailing一步法反应，体系如下：

DNA 800ng

FEA buffer 5μL

加水至 40μL

将上述样品混合均匀后，立即加入FEA Enzyme Mix 10μl，置于PCR仪中进行反应；

b.进行Adapter Ligation反应，体系如下：

将上述样品混合均匀后，置于PCR仪中进行反应；

c.将最终产物进行纯化，最后产物洗脱于20μl的TE buffer中；

③Tag-seq文库构建：

将纯化DNA产物分别进行文库-L及文库-R构建，PCR具体条件如下：

引物：

P5：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC

Tag-L-F1：CGCTTCTCGATAACACGCATTTCGCATAAG

Tag-R-F1：CGCTTATTCTGAGCCTTATGCGAAATGCGT

进行第一轮PCR，体系如下：

进行第二轮PCR:直接在第一轮PCR的产物中加入以下混合物

引物：

P5：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC

Tag-L-F2：CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGCATTTCGCATAAGGCTCAGA

Tag-R-F2：CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTATGCGAAATGCGTGTTATCG

P7-1:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

P7-2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

P7-3:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

P7-4:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

P7-5:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

P7-6:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

第二轮PCR体系如下：

将最终PCR产物进行纯化，最后产物在TE buffer中洗脱；

④对文库进行PE 150测序；

Tag-seq数据生物信息学分析；

a.Read1-R1的分析：R1序列中含sample barcode，用于多样品区分，R1序列中含UMI，用于PCR重复扩张的去重；

b.Read2-R2的分析：R2含Tag序列，用于确定插入基因组位置，即潜在脱靶位置；其中存在以下4种情况：文库-L中，Tag正向插入和反向插入；文库-R中，Tag正向插入和反向插入；

潜在脱靶位点的确定如下：

a.被检测位点不存在于Control库中；

b.被检测位点出现所述4种情况中2种以上；

c.被检测位点的前后50bp与目标sgRNA比对少于7个碱基错配；

符合以上条件则确定为潜在的脱靶位点，进一步应用Deep-seq进行验证。

2.一种检测脱靶效应方法应用，其特征在于，将权利要求1中所述的检测脱靶效应方法应用于检测细胞中脱靶情况；

所述方法应用于在HEK293T及MCF7细胞中检测AsCpf1-Site6的脱靶情况；

所述方法应用于在HEK239T细胞中检测野生型SpCas9、eSpCas9和Cas9-HF高保真版本在基因位点EMX1的脱靶情况；

所述方法应用于在HEK239T细胞中检测另一类核酸酶AsCpf1和LbCpf1在基因位点CCR5中的脱靶情况。