[发明专利]一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用

说明书

本申请公开了一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用，所述方法通过基因克隆技术特别设计开发特定CRP编码基因，并以pAO815为模板进行改造构建自诱导分泌表达酵母载体，将所述CRP编码基因克隆至改造后含有GAP启动子及α‑factor分泌信号肽基因的pAO815载体上，并完成四拷贝重组质粒的筛选以及单克隆转化子的筛选，再运用发酵罐技术完成CRP蛋白的分泌表达，最终通过ECH填料纯化，得到纯度高于90％的CRP蛋白。

技术领域

本申请属于生物技术领域，特别涉及一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP蛋白)是一种典型的急性期血浆蛋白，由于其血浆浓度在响应炎症反应时能够从基线低浓度(＜1μg/mL)迅速增加1000倍以上，因此，长期以来作为临床上炎症反应的非特异性标示物。图1示出天然CRP蛋白的结构示意图，如图1所示，天然CRP蛋白由五个相同的亚单位以非共价键形式结合成对称的五聚体，其相对分子质量为115kD，具体地，五个亚单位聚合形成环状结构，在酸性或碱性环境中，天然的CRP蛋白可分解为五个单体，每个单体即为一个亚单位。天然CRP蛋白的每个亚单位具有206个氨基酸残基，相对分子质量为23kD。天然CRP蛋白中每个亚单位均含有磷酸胆碱结合位点，如图1中第一球系(1)圆球区域所示，进一步地，每个亚单位上临近疏水口袋的位置均有两个钙离子结合位点，如图1中磷酸胆碱旁边的第二球系(2)所示，并且，所有亚单位的磷酸胆碱结合位点均位于天然CRP蛋白环状结构的同侧，将天然CRP蛋白上存在磷酸胆碱结合位点的一面称为识别面，与识别面相对的面称为效应面，所述效应面可与效应因子结合，由于所述效应因子由炎症反应而产生，因此，可据CRP蛋白上是否结合有效应因子来判断供样机体是否存在炎症反应，其中，所述效应因子可以为补体成分C1q或者细胞表面Fcy受体。

目前常采用免疫分析法来检测血浆中CRP蛋白含量，因此，需使用大量高质量的标准品作为对照，作为对照的CRP蛋白质需要活性高、稳定性好，经过长时间贮存而活性几乎无下降。目前市售的CRP蛋白标准品的来源多样，例如，来自大肠杆菌系统表达而得，或者，由患者CRP阳性胸腹水中天然提取。一般地，高品质CRP蛋白来源于天然提取，但是，由于天然提取的CRP蛋白价格昂贵，并且，原料来源并不完全稳定，严重阻碍CRP蛋白标准品等诊断产品的研究开发，因此，科研人员转向利用基因工程研发大量生产CRP的方法。

CRP编码基因，即，用于编码CRP蛋白的基因，属于穿透素家族成员之一，位于人类1号染色体q23区域，其基因序列高度保守。现有技术中存在以色氨酸启动子、CRP编码基因、Kil基因以及来自于大肠杆菌ALP区域的信号肽融合构建重组质粒，再通过在E.coli NM522菌株中成功分泌表达CRP蛋白的方法，该方法通过发酵罐发酵可达到30mg/L的高表达量，进一步地，使用ECH-Sepharose 4B成功纯化CRP蛋白。但是，大肠杆菌系统表达的CRP蛋白结构较为单一，可能出现蛋白折叠不正确或者糖基化不完全的情况，进而会导致CRP蛋白活性不足或者稳定性不足。因此，科研人员期待在真核酵母系统中制备CRP蛋白，从而获得满足使用要求的CRP蛋白。

现有技术中存在将人源CRP编码基因克隆构建到甲醇酵母表达载体pPICZαA上，在甲醇诱导表达菌株X-33中利用甲醇诱导进行分泌表达的方法，并且，利用组氨酸标签进行亲和层析纯化rhCRP。但是，利用甲醇诱导型载体不仅需要在菌体培养过程中进行培养基换液，还需要补加诱导剂甲醇，上述操作容易造成杂菌污染，特别地，如果需要进行发酵罐发酵培养，则上述因素均容易造成经济损失。

发明内容

为解决上述问题中的至少一个，本申请提供了一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，所述方法利用融合有CRP编码基因的重组质粒在毕赤酵母GS115菌株中分泌表达制备CRP蛋白的方法。

本申请的目的在于提供一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，所述方法包括：

步骤1，将CRP蛋白编码基因克隆至pAO815Gα载体中构建单拷贝重组质粒；