[发明专利]一种PS转座酶与CRISPR/dCpf1融合蛋白表达载体及其介导的定点整合方法

说明书

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种PS转座酶与CRISPR/dCpf1融合蛋白表达载体及其介导的定点整合方法，本发明通过DNA重组技术，制成转座酶和切割缺陷型Cas酶(dCpf1)的融合表达系统，该系统表达的融合蛋白与转座子介导的基因片段、crRNA形成的复合物在crRNA引导下与靶位点特异性结合，在靶位点进行定点整合，从而可以实现基因大片段高效定点整合，同时该技术由于去除了CRISPR系统基因切割功能，避免了脱靶效应的产生。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种PS转座酶与CRISPR/dCpf1融合蛋白表达载体及其介导的定点整合方法，通过gRNA定点导向，实现在生物基因组中实现转座子定点整合的方法。

背景技术

背景技术是指与本发明最接近(如用途、功能、结构等)的对比文件。描述背景技术时，要具体介绍其内容(如目的、构成、效果)，指出其存在的问题和不足之处，并在可能条件下说明原因。

CRISPR/Cas9系统作为基因编辑工具引起广泛关注源于Cong等学者2013年在国际顶级杂志SCIENCE上的一篇报道，它主要基于细菌的一种获得性免疫系统即串联调节性间隔重复序列(CRISPR)改造而成。CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA三种成分组成。其中Cas9蛋白本身既具有核酸内切酶活性，又能与tracrRNA和crRNA复合物结合，该蛋白含有两个独特的活性位点，分别是位于氨基末端的RuvC和蛋白中部的HNH，这两个位点在crRNA的成熟及双链DNA的剪切过程中发挥重要作用。

迄今为止，CRISPR/Cas9技术已成功应用于细菌、酵母、拟南芥、玉米、水稻和小麦、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、人以及多个物种细胞系(包括iPS细胞)内源性基因的编辑，包括大基因片段的敲除，基因的敲入，基因精确修饰，已经成功获得猪、牛、羊等大型家畜的CRISPR/Cas9基因编辑转基因动物。

Cpf1蛋白是在CRISPR系统研究中发现的新成员，与CRISPR/Cas9系统相比，CRISPR/Cpf1与其功能类似，但可能更简单、更精准，并能克服原有的CRISPR/Cas9系统应用中的一些限制，在基因组编辑中显示更好的应用前景。CRISPR/Cpf1系统与CRISPR/Cas9系统的差别主要体现在:(1)天然的CRISPR/Cpf1系统在组成上更加简单，仅仅包含一条42nt的crRNA，另外Cpf1蛋白比Cas9蛋白要小，使其更易于被设计和输送至细胞内；(2)CRISPR/Cpf1系统以一种不同的方式切割靶DNA。CRISPR/Cas9系统切割靶DNA双链后留下的―平末端‖在修复时容易发生突变，因此严格来讲，CRISPR/Cas9系统对靶基因实行的是破坏而不是编辑，CRISPR/Cpf1系统则在切割靶DNA后留下―黏性末端‖，这可能有助于外源DNA片段的精确整合，从而实现真正意义上的基因组编辑；(3)与CRISPR/Cas9系统类似，CRISPR/Cpf1系统对靶DNA的识别同样依赖PAM序列的存在，不过Cas9系统识别的是前间隔序列3'端的NGG PAM序列，而Cpf1系统识别前间隔序列5'端TTN PAM序列；(4)CRISPR/Cpf1系统会在距离识别位点较远的位置进行切割，这为研究人员提供了更多的编辑位点。同时，已有研究证明CRISPR/Cpf1系统的脱靶率远远低于CRISPR/Cas9系统。应用CRISPR/Cpf1技术也已经获得基因编辑转基因动植物(水稻、鼠、斑马鱼)。

CRISPR技术对基因小片段进行定点突变效率比较高，与其它技术相比，具有明显优势，但CRISPR技术对基因大片段定点整合需要依赖于内源性同源重组系统，效率还比较低，另外脱靶效应是CRISPR技术的另一主要不足，在生物体庞大的基因组中很容易出现脱靶位点，从而引入意外突变。