[发明专利]一种PS转座酶与CRISPR/dCpf1融合蛋白表达载体及其介导的定点整合方法

权利要求书

1.一种质粒融合转座酶载体，其特征在于，所述载体的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种PS转座酶与CRISPR/dCpf1融合蛋白表达载体，其特征在于，所述载体包含CAG启动子、Kozak序列、2个SV40 NLS序列、dCpf1序列、linker序列、PS转座酶序列；

所述CAG启动子的序列为SEQ ID NO:1中自5’端第5～1654位碱基；

所述Kozak序列为SEQ ID NO:1中自5’端第1773～1782位碱基；

所述2个SV40 NSL序列分别为dCpf1序列上游和下游；

所述dCpf1序列为SEQ ID NO:1中自5’端第2427～6107位碱基，其中序列为突变体，为DNA剪切活性缺失型蛋白；

所述linker序列为SEQ ID NO:1中自5’端第6135～6179位碱基；

所述PS转座酶序列为SEQ ID NO:1中自5’端第6180～7451位碱基。

3.根据权利要求2所述的PS转座酶与CRISPR/dCpf1融合蛋白表达载体，其特征在于，所述linker序列包含15个氨基酸残基。

4.根据权利要求2所述的PS转座酶与CRISPR/dCpf1融合蛋白表达载体，其特征在于，所述2个SV40 NSL序列为SEQ ID NO:1中自5’端第2400～2420位碱基、第6114～6134位碱基。

5.权利要求1所述质粒融合转座酶载体或权利要求2～8任一项所述PS转座酶与CRISPR/dCpf1融合蛋白表达载体在转座子介导定点整合中的应用。

6.一种融合转座酶介导转座子定点整合的方法，其特征在于，包括如下步骤：

设计靶向目的基因的gRNA序列；

构建cpf1 gRNA表达载体；

将带有目的基因gRNA的表达载体和权利要求1所述的质粒融合转座酶载体和转座子供体质粒共转染宿主细胞，使转座子供体序列定点转座整合到目的基因；

使用抗性筛选基因筛选得到插入报告基因的阳性单克隆细胞；

吉姆萨染色统计阳性细胞克隆数，并挑取阳性单克隆细胞，荧光定量检测目的基因的表达情况。

7.根据权利要求6所述的融合转座酶介导转座子定点整合的方法，其特征在于，设计靶向目的基因的gRNA序列所用的引物序列如下：

HPRT1-gRNA-F:GTAGATTGTCCCCTGTTGACTGGTCATTC；

HPRT1-gRNA-R:AATTGAATGACCAGTCAACAGGGGACA。

8.根据权利要求6所述的融合转座酶介导转座子定点整合的方法，其特征在于，以pSQT14载体为gRNA表达载体为框架，所述pSQT14载体含有如下序列：AATTTCTACTAAGTGTAGAT。

9.根据权利要求6所述的融合转座酶介导转座子定点整合的方法，其特征在于，所述pSQT14载体的序列如SEQ ID NO:2所示。

10.根据权利要求6所述的融合转座酶介导转座子定点整合的方法，其特征在于，所述带有目的基因gRNA的表达载体的序列如SEQ ID NO:3所示。