[发明专利]SpRYn-ABE碱基编辑系统在植物基因组碱基替换中的应用

说明书

本发明公开了SpRYn‑ABE碱基编辑系统在植物基因组碱基替换中的应用。本发明的SpRYn‑ABE碱基编辑系统包括SpRYn、腺嘌呤脱氨酶和esgRNA；所述esgRNA靶向靶点序列；所述esgRNA如式I所示：所述靶点序列转录的RNA‑esgRNA骨架(式I)。通过实验证明：本发明的SpRYn‑ABE碱基编辑系统可对位于植物基因组上的PAM序列为NAN或NCN或NTN的靶点序列中的碱基A进行编辑，实现碱基A到碱基G的替换，大大拓展了可编辑的A的范围。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及SpRYn-ABE碱基编辑系统在植物基因组碱基替换中的应用。

背景技术

CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9 protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。

2017年，David Liu实验室报道了一种新型的腺嘌呤碱基编辑器(adenine baseeditors，ABE)。通过七轮进化，研究者将来源于大肠杆菌的tRNA腺嘌呤脱氨酶(tRNAadenosine deaminase，ecTadA)融合在Cas9 nickase(Cas9n)的5’端，在细胞内能够直接实现对单个碱基A(Adenine，A)到G(Guanine，G)的替换，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了A替换为G的碱基编辑效率。具体过程为：当含有基因组靶向序列的sgRNA与ecTadAecTadACas9n结合时，复合体定位到靶点，ecTadA催化非配对的单链DNA上的A发生腺嘌呤脱氨反应变成肌苷(Inosine，I)，在DNA修复的过程中，I会被视为G，Cas9n会在切割配对的DNA链的磷酸二酯键，引入一个胞嘧啶C(Cytosine)与I配对。最终在接下来的修复过程中产生C-G配对，从而实现了A到G的转换。

目前，ABE系统已被广泛应用到植物中，实现A到G的转换，但编辑的靶点主要局限在PAM(Protospacer Adjacent Motif)为NGN的序列，对于NAN，NCN，NTN PAM靶点进行A到G的碱基编辑鲜有报道，大大限制了可编辑的A的范围。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种将植物基因组靶点序列中的A突变为G的方法。

本发明提供的将植物基因组靶点序列中的A突变为G的方法为如下1)或2)：

所述1)包括如下步骤：将SpRYn、腺嘌呤脱氨酶和sgRNA导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的A突变为G；

所述2)包括如下步骤：将SpRYn的编码基因、腺嘌呤脱氨酶的编码基因和转录sgRNA的DNA分子导入植物体内，使所述SpRYn、所述腺嘌呤脱氨酶和所述sgRNA均得到表达，实现将植物基因组靶点序列中的A突变为G；

所述sgRNA靶向靶点序列；

所述靶点序列的PAM序列为NAN或NCN或NTN；N为A、T、C或G。

上述将植物基因组靶点序列中的A突变为G的方法中，所述sgRNA为esgRNA；

所述esgRNA如式I所示：所述靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架(式I)；

所述esgRNA骨架为n1)或n2)或n3)：