[发明专利]高密度细胞存储方法

说明书

本申请涉及高密度细胞存储方法，具体地提供一种使用灌注培养技术和细胞的非离心浓缩来创建高密度冷冻保存细胞库的方法。还提供使用这种高密度冷冻保存的细胞库的生产方法。

本发明申请是基于申请日为2014年3月14日，申请号为201480015761.2(国际申请号为PCT/US2014/027757)、名称为“高密度细胞存储方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求2013年3月15日递交的美国临时申请No.61/793,021的优先权，将其内容通过提述以其整体并入本文用于全部用途。

背景技术

常规细胞存储(cell banking)广泛用于保存冷冻的、特征性的细胞，这些细胞可能被解冻用于多种应用，包括治疗相关蛋白的生产。通常而言，将冷冻保存的储液(cryopreserved stock)以较低的密度保存，或者离心以生成更高密度的等分试样用于储存。较低密度的储液不允许有效接种大体积的培养物，而基于离心的浓缩方法对于细胞可以是非常有破坏性的(在冷冻保存过程期间细胞会变得更加脆弱)。因此，需要改进的细胞存储方法。

发明内容

本公开提供了改进的创建细胞库的方法。在某些方面，本发明的细胞存储方法采用灌注培养技术和细胞的非离心浓缩以允许以出乎意料高的细胞密度进行冷冻保存，同时保持出色的细胞活力以供稍后在生产细胞培养物中使用。

因此，在一方面，本发明提供用于产生高密度冷冻细胞库的非离心方法，所述方法包括：a)在灌注生物反应器中培养细胞，其中所述生物反应器与细胞保留系统偶联；b)以非离心的方式浓缩所述细胞以产生浓缩的细胞群体；和c)冷冻保存浓缩的细胞群体以产生高密度冷冻细胞库。

在一个实施方案中，所述细胞保留系统包含交替切向流过滤系统(alternatingtangential flow filtration system)，所述交替切向流过滤系统包含过滤器。在另一个实施方案中，所述过滤器具有至少0.3m²的表面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有约0.5至约1.0m²的表面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有约0.7至约0.8m²的表面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有约2.0至约3.0m²的表面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有约4至约5m²的表面积。

在一个实施方案中，所述过滤器具有约0.2μm的孔径。

在一个实施方案中，所述浓缩的细胞群体具有至少约1x10^8个细胞/mL的细胞密度。

在一个实施方案中，所述浓缩的细胞群体具有约1x10^8个细胞/mL的细胞密度。

在一个实施方案中，所述冷冻保存包括以约5％至约10％体积/体积的终浓度将DMSO添加至浓缩的细胞群体。在另一个实施方案中，所述冷冻保存包括将至少一部分浓缩的细胞群体冷冻在适合于在冷冻保存条件下储存的容器中。

在一个实施方案中，所述容器是小瓶。在一个实施方案中，所述容器具有至少2mL的体积。在一个实施方案中，所述容器具有约5mL的体积。

在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库包含约4.5x10^8个细胞。

在一个实施方案中，所述容器是冷冻袋。在另一个实施方案中，冷冻袋具有约5至约150mL的体积。

在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库具有约1x10^8个细胞/mL的细胞密度。

在一个实施方案中，所述灌注生物反应器中的灌注速率为至少约0.2nL/细胞/天。

在一个实施方案中，所述灌注生物反应器细胞培养物具有约7的pH和至少约40％的溶解氧浓度。