[发明专利]一种提高4,6-α-葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法

说明书

本发明公开了一种提高4,6‑α‑葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法，属于蛋白质工程和发酵工程技术领域，具体涉及分别以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为宿主表达来源于发酵乳杆菌的4,6‑α‑葡萄糖基转移酶(GtfB)过程中，在发酵培养基中添加甜菜碱、麦芽糖、β‑环糊精、海藻糖、山梨醇小分子物质，提高4,6‑α‑葡萄糖基转移酶(GtfB)可溶性表达量的方法，使得发酵总酶活本发明为高效表达4,6‑α‑葡萄糖基转移酶(GtfB)提供了一个有效的策略，操作工艺简单，且成本较低，效果显著，为工业化生产奠定了基础。

技术领域

一种提高4,6-α-葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法，属于蛋白质工程和发酵工程技术领域。

背景技术

4,6-α-葡萄糖基转移酶属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)70家族，该家族的酶可以利用蔗糖或淀粉为底物合成各种结构的α-葡聚糖，因此广泛应用于食品领域。

4,6-α-葡萄糖基转移酶大部分来源乳酸杆菌目(Lactobacillaceae)。由于野生菌发酵水平较低，通过异源表达提高表达量。大肠杆菌(Escherichia coli)由于其遗传背景清晰、基因工程技术操作成熟作为最广泛应用的宿主。一般情况下，大肠杆菌表达外源蛋白质有三种方式，胞内表达、周质空间表达、胞外分泌。随着食品安全意识提高，枯草芽孢杆菌(Lactobacillus fermentum)作为食品安全菌，表达异源蛋白质也越来越受到重视。无论是大肠杆菌还是枯草芽孢杆菌为宿主菌发酵产酶，经常遇到外源蛋白质，形成无活性的包涵体，以不可溶的形式出现在细胞液中。

4,6-α-葡萄糖基转移酶发酵过程中也遇到同样的问题。人们一般采用复杂的基因工程手段，从核酸水平、基因表达水平、发酵水平，试图提高蛋白质的可溶性表达量。这些技术手段对某些蛋白质的可溶性表达的确取得了一些效果，但是周期长、操作复杂、成本高这些缺地依然存在，难以克服。最关键的一点，对于很多外源蛋白质可溶性表达量始终难以提高。因而限制了4,6-α-葡萄糖基转移酶的大规模生产及在工业生产中的应用。

发明内容

面对这些难点针对目前存在的问题，本发明提出了在培养基添加小分子物质提高外源蛋白质的可溶性表达量的策略。由于小分子物质甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖、山梨醇可以提高菌株在恶劣的环境中的耐受性，保护细胞免受损伤，同时对细胞液中蛋白质的正确折叠起到重要的辅助作用以及对可溶性蛋白质的稳定性起到积极的影响，因此提高了细胞液中蛋白质的可溶性表达量。

本发明的第一个目的是提供一种提高重组菌外源蛋白表达量的方法，在重组菌发酵的体系中添加小分子物质。

在本发明的一种实施方式中，所述小分子物质包括甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖或山梨醇中的一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，所述外源蛋白包括4,6-α-葡萄糖基转移酶。

在本发明的一种实施方式中，所述外源蛋白还包括4,6-α-葡萄糖基转移酶的同家族酶。

在本发明的一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述同家族酶结构相似，功能相同，均能将底物淀粉的α-1,4糖苷键转化成α-1,6糖苷键，所述同家族酶包括来源于Exiguobacteriumsp.RIT341、Burkholderia sp.NFACC38-1、Frateuriadefendens和Limosilactobacillusfermentum的酶。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于Exiguobacterium sp.RIT341的酶NCBI登录号为WP_035410561；