[发明专利]一种CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于IL-2的活性检测的用途及方法

说明书

本发明涉及IL‑2活性检测领域，具体是一种经CAR‑T培养基驯化的CTLL‑2细胞用于IL‑2的活性检测的用途及方法，本发明提供了经CAR‑T培养基驯化后的CTLL‑2细胞库，同时建立了将驯化后的该细胞用于IL‑2的活性检测方法，包括以下步骤：以CAR‑T基础培养基为稀释液，配制不同浓度的IL‑2标准样品溶液；将经CAR‑T培养基驯化的CTLL‑2细胞分别与各不同浓度的标准样品溶液和待测样品溶液混合，并在适合CTLL‑2细胞生长的环境下同时孵育；加入CCK8溶液孵育后显色并检测吸光度；计算待测样本中IL‑2的相对活性。驯化后的CTLL‑2细胞适用于CAR‑T培养基中IL‑2活性的检测，避免了在通用IL‑2活性检测法中存在RPMI1640培养基导致的检测干扰，具有很好的准确度和重复性。

技术领域

本发明涉及IL-2活性检测领域，特别是涉及一种CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于IL-2的活性检测的用途及方法。

背景技术

目前的IL-2活性检测，报道最多的是基于CTLL-2细胞(1640培养基+胎牛血清的培养体系)来进行检测，该体系下它对人IL-2的反应性良好。这种方法我们暂且称之为“通用的IL-2活性检测法”。该方法也被写入了2015年药典《3524重组人白介素-2生物学活性测定法》

肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的治疗模式，也是当前认为最有效的一种治疗方式。目前，免疫治疗技术CAR-T细胞对多种血液肿瘤显示了非常好的临床效果，对实体瘤治疗也表现出了非常大的潜力。CAR-T技术通过体外对T细胞进行改造、扩增，然后回输给病人进行治疗。体外扩增多为CAR-T培养基+人血清的培养体系，在扩增阶段，IL-2是非常重要的一种外源添加因子，用于刺激T细胞增殖。IL-2的添加数量与CART细胞的收获时间、产品的质量息息相关。因此，适用于CAR-T培养基体系的反应性良好的IL-2的活性检测方法的建立就显得非常重要。例如：IL-2在CAR-T培养基中的稳定性研究；IL-2在CAR-T工艺不同阶段的活性变化研究等，这些都是工艺开发时的重要研究点。

通用IL-2活性检测法《3524》中，先用RPMI1640基础培养体系大比例稀释待测样本至IL-200IU/ml作为起始浓度点，进行检测(大比例稀释可以消除样本原有基质对检测的干扰，若有)。然而，基于CAR-T工艺参数，我们预估CAR-T培养基中IL-2的浓度为0-500IU/ml。IL-2过低，不利于细胞增殖速率提升，细胞增殖慢；IL-2过高，往往会导致Treg细胞比例增大，从而不利于CAR-T杀伤功能实现。因此，CAR-T工艺培养基中IL-2浓度无法大比例稀释(例如:10倍的稀释)来降低基质本身潜在干扰，因为稀释前的浓度已经接近通用IL-2活性检测法中要求的起点浓度水平。CAR-T培养基(X-vivo培养基)是优化后的利于人T淋巴细胞生长的培养基，若不能大比例稀释，在不稀释的情况下参照药典《3524》方法的其他步骤，在测试孔分别加入100ul细胞(RPMI1640培养基)和100ul待测物(CART培养基)，就面临测试系统里面含有CAR-T培养基比例较高对分析造成未知干扰，无法准确测定IL-2活性的问题，此外，CTLL-2细胞应用于检测IL-2活性时，还存在细胞复苏时耗时长，细胞状态恢复慢，难复苏的问题。因此，我们认为需要建立一种反应良好且适用于CAR-T培养基体系的IL-2的活性检测方法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测IL-2的方法，用于解决现有技术中CTLL-2细胞复苏时耗时长和CART培养基在通用IL-2活性的检测存在潜在干扰的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于CAR-T工艺各阶段培养基中IL-2的活性检测的用途。

在一实施例中，将经CAR-T培养基驯化的CTLL-2细胞用于CAR-T培养时，培养基中IL-2的活性检测。

在一实施例中，CAR-T细胞培养时，培养基中IL-2的浓度大于或等于100IU/ml且小于200IU/ml。