[发明专利]基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒及其制备方法

说明书

本发明提供了基于胶乳增强免疫比浊法测定N‑MID的试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括反应缓冲液与N‑MID胶乳试剂，所述反应缓冲液与所述N‑MID胶乳试剂体积比为4:1，所述反应缓冲液包括0.5‑5g/L的缓冲液、10‑25g/L的无机盐、15‑40g/L的增浊剂、0.5‑2ml/L的防腐剂和25‑50ml/L的稳定剂，溶剂为纯化水，所述N‑MID胶乳试剂包括至少两种胶乳试剂，所述胶乳试剂由单抗与胶乳微球偶联而成。本发明可以使用全自动生化分析仪检测N‑MID，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响并且价格上会有很大的优势。

技术领域

本发明涉及生物检测试剂制备领域，具体涉及基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒及其制备方法。

背景技术

人N端中段骨钙素(N-MID Osteocalcin)：骨钙素是成熟成骨细胞分泌的一种非胶原骨基质蛋白，占骨基质中非胶原蛋白成分的25﹪，骨总蛋白的2﹪。完整的骨钙素有49个氨基酸组成，相对分子质量为5800。血清中的骨钙素具有多样性，约三分之一为完整骨钙素，三分之一为骨钙素N端中分子(N-MID)片段，三分之一为氨基酸短肽。骨钙素是成骨细胞功能和骨质矿化的特殊标志物，作为骨转换标志物逐渐被临床应用。目前国内大多数用酶联免疫法测定全段骨钙素，由于全段骨钙素自身稳定性较差，标本存放温度与时间会影响实验结果。

检测N-MID的方法主要基于抗原抗体反应.现有某公司已注册N-MID测定试剂盒(荧光免疫层析法)与(电化学发光免疫层析法)，为境内第二类医疗器械，进口的有电化学发光法测定试剂盒与化学发光法测定试剂盒。目前，市场上N-MID测定试剂盒以免疫学方法为主，但是现有的检测方法存在一定的缺陷，检测步骤繁琐，操作难度较大，且检测的效率低，精密性不佳，检测的结果受操作的影响，并且价格较高。

发明内容

本发明的目的是解决上述的不足，提供一种基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒及其制备方法，旨在解决现有市场上流通的检测骨钙素N端中分子片段的试剂盒缺点，可以使用全自动生化分析仪检测骨钙素N端中分子片段，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好。

为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒，包括反应缓冲液与N-MID胶乳试剂，所述反应缓冲液与所述N-MID胶乳试剂体积比为4:1，所述反应缓冲液包括0.5-5g/L的缓冲液、10-25g/L的无机盐、15-40g/L的增浊剂、0.5-2ml/L的防腐剂和25-50ml/L的稳定剂，溶剂为纯化水，所述N-MID胶乳试剂包括至少两种胶乳试剂，所述胶乳试剂由单抗与胶乳微球偶联而成。

进一步的，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液中的任一种。

进一步的，所述无机盐选自氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的任意一种或两种以上的按任意比例混合的混合物；所述增浊剂选自聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的任意一种或两种以上的按任意比例混合的混合物。

进一步的，所述防腐剂为Proclin300或硫柳汞；所述稳定剂选自BSA、蔗糖、甘露醇中的任意一种或两种以上的按任意比例混合的混合物。

根据本发明的另一个方面，基于胶乳增强免疫比浊法测定N-MID的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，量取0.1-0.5ml固含为10％的胶乳微球，加至磷酸盐缓冲液中进行清洗，之后在20000转/分钟的转速下进行离心30min后，去上清，用MES缓冲液对余下沉淀物重悬超声，加入质量浓度为2％的EDAC 0.1ml和质量浓度为4％的NHS 0.2ml进行活化，活化时间为0.5h，制得活化胶乳微球；